miRNA在儿童急性淋巴细胞白血病GC反应性中的作用研究

糖皮质激素(GC)是儿童急淋的主要治疗手段之一，而白血病细胞对GC 的敏感性与治疗效果和预后密切相关。目前临床上一直无法在患者使用GC前对GC反应性做出判断。我们前期研究提示在不同GC反应性ALL患儿GC受体（GR）mRNA水平未见不同，但存在GR转录活性的不同；小规模miRNA表达谱筛查提示存在miRNA的差异表达。本项目拟：首先对GC反应性相关的miRNA进行确认，着重研究miRNA和GR的相互作用,进一步深入探讨GC抵抗的分子生物学机制，为诊断、逆转GC抵抗提供新的靶点；另一方面，着手建立GC抵抗的体外分子诊断方法，为临床早期诊断和评估患者的GC反应性、确立个体化治疗方案提供可靠的技术、方法，从而实现GC的个体化医疗。

儿童急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）是儿童中发病率最高的恶性肿瘤。虽然糖皮质激素（glucocorticoid，GC）是一线治疗药物，但是患儿个体反应的差异性限制了GC的临床运用。已经公认对GC治疗是否敏感是判定小儿ALL预后的一项强烈的、具有独立意义的指标。因此，了解GC抵抗的机理、寻找能够逆转GC抵抗或能与GC协同作用而克服ALL细胞对GC抵抗的方法，是进一步提高儿童ALL治愈率的重要途径。近期研究提示microRNA（miRNA）在GC抵抗中发挥了重要的调控作用。通过研究不同GC反应性的ALL患儿中miRNA的差异表达及其如何影响GC反应机制、如何逆转GC抵抗，以期能够建立GC抵抗体外分子诊断方法并为探索GC抵抗治疗靶点奠定基础。方法：收集了67例儿童ALL骨髓标本，其中52例GC敏感患儿骨髓样本和15例ALL GC抵抗患儿骨髓样本。采用μParaflo微流体芯片进行差异miRNA表达谱分析；以qRT-PCR验证差异miRNA；用差异miRNA mimic/inhibitor 转染急淋细胞株，流式细胞术检测细胞对GC诱导凋亡的变化；荧光素酶报告基因系统检测差异miRNA与GC信号分子特异的靶对关系。并采用qRT-PCR、Western Blot等方法在不同GC反应的ALL患儿及急淋细胞株中检测miRNA的表达及NR3C1基因及GR蛋白的表达情况。结果：在所检测的2555个人类miRNA中，相较于GC敏感ALL患儿，GC抵抗的ALL患儿显著上调的差异miRNA共22个，显著下调的miRNA共21个。qRT-PCR验证了与GC信号通路相关的3个miRNA的差异表达，与芯片结果一致。GR蛋白在GC敏感细胞及GC敏感ALL患儿中呈高表达，而在GC抵抗细胞/GC抵抗患儿中呈低表达；转染miRNA15b mimic，可以引起NR3C1及GR蛋白的增加以及GC诱导细胞凋亡增加（P<0.01），而miRNA15b inhibitor的转染减少了NR3C1及GR蛋白的表达以及GC诱导凋亡（P<0.05）。靶对实验证实了miRNA15b对GC信号通路分子有着转录后调控的作用。结论：miRNA15b可能成为今后临床早期诊断和评估患者的GC 反应性的新指标，该研究也为逆转GC抵抗提供了新思路，为临床实现GC的精准医疗奠定基础。