布鲁氏菌中非编码小RNA的预测、鉴定及其在胞内生存中的调控作用研究

胞内生存是布鲁氏菌致病的关键环节，而适应胞内环境则是布鲁氏菌实现胞内生存的关键。非编码小RNA（sRNAs）在细菌适应环境压力、代谢和毒力的基因调控中发挥重要作用。本实验室前期研究证实，布鲁氏菌中也存在sRNAs，且可能与细菌的胞内生存有关。因此，本项目拟首先利用生物信息学方法，从全基因组水平预测布鲁氏菌中的sRNAs，利用RT-PCR、Northern、RACE等实验对预测的sRNAs进行验证；鉴定为阳性的sRNAs分子，构建其缺失突变株和互补株，通过体外表型、细胞和小鼠实验等分析这些sRNAs是否与布鲁氏菌的胞内生存能力和毒力相关；并通过靶标mRNA的寻找，分析这些sRNAs如何通过激活或抑制靶标mRNA来调控布鲁氏菌的胞内生存，探讨sRNAs在布鲁氏菌适应胞内环境中的基因调控作用，进一步阐明布鲁氏菌的胞内生存机制，并为布鲁氏菌的药物和疫苗研发提供理论依据。

布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，胞内生存是布鲁氏菌致病的关键环节，而适应胞内环境则是布鲁氏菌实现胞内生存的关键。非编码小RNA（sRNAs）在细菌适应环境压力、代谢和毒力的基因调控中发挥重要作用。本项目的研究目的是寻找布鲁氏菌内的sRNAs，并探讨其在布鲁氏菌胞内生存中的作用。. 本项目首先通过生物信息学的方法从全基因组水平预测羊布鲁氏菌中的sRNAs，并对预测的sRNAs进行实验验证，共得到15个sRNAs，其中有8个为单独转录的sRNAs。这8个sRNAs均为新的sRNAs，在布鲁氏菌种中具有高度的保守性。qRT-PCR分析这8个sRNAs在不同压力条件下的表达，发现有些sRNAs可能在布鲁氏菌适应环境压力条件中发挥作用。选择其中的BSR16进行进一步的功能分析。. BSR16在酸、营养缺乏、热及氧化压力条件下的表达均发生上调，提示BSR16在布鲁氏菌适应环境压力条件中发挥一定的作用。为分析BSR16在布鲁氏菌胞内生存中的作用，RACE实验寻找BSR16的转录起点和终点，并构建BSR16的缺失突变株和过表达株。体外表型实验结果显示，BSR16过表达以后，布鲁氏菌在模拟巨噬细胞内环境条件下的生存能力明显下降。进一步的小鼠毒力实验证实BSR16与布鲁氏菌的胞内生存能力和毒力相关。比较蛋白质组分析结果显示，BSR16过表达之后，很多蛋白的表达发生改变，包括重要的压力适应蛋白HtrA、SodA和GroEL。生物信息学预测BSR16的靶标，RT-PCR证实BSR16影响了gntR和arsC的表达。双质粒系统实验进一步证实了BSR16对gntR的直接调控作用，确认了gntR为BSR16的直接作用靶标。 . 本项目共发现了8个新的布鲁氏菌sRNAs，并对其中的胞内生存相关sRNA BSR16的功能进行了分析，发现BSR16通过调控gntR来影响布鲁氏菌的胞内生存能力。本研究结果在布鲁氏菌病的预防和治疗中发挥重要作用。通过本项目研究，有1名博士研究生和1名硕士研究生顺利毕业，1名研究人员成长为中青年学术带头人。申请专利1项，发表SCI论文5篇。