肽核酸核定位靶向抑制K-ras基因表达治疗胰腺癌的实验研究

K-ras基因突变在胰腺癌发生发展中具有重要意义，阻断该基因可抑制胰腺癌细胞的生长、增殖和分化。既往研究表明在基因抑制方面，传统寡核苷酸类抑制药物存在着易降解、专一性差及有一定毒性作用的问题，难以在临床开展。新型核酸类似物- - 肽核酸（PNA）由于其高特异性、无毒性成为基因抑制的理想选择。前期实验证实PNA与相应完全互补的K-ras靶序列之间有着很高的亲和力和特异性，并且初步证实连接上核定位信号肽（NLS），有助于改善PNA的膜通透性。因此，本研究旨意创新性地运用PNA核定位靶向抑制点突变K-ras基因，研究其对胰腺癌细胞株及胰腺癌小鼠模型体内抑制肿瘤生长、转移的作用机制与效果，为临床建立胰腺癌特异性疗法提供重要依据。同时，创新性地运用核定位信号肽（NLS）修饰肽核酸，解决了肽核酸在基因应用领域的局限性。

一、K-Ras靶向PNA抑制胰腺癌的体外研究.连接有核定位信号肽的PNA，能够顺利穿过细胞膜及核膜，成功定位于核内，其不具有细胞选择性，入核关键主要在于核定位信号肽，与PNA序列无关。而未连接有核定位信号肽的裸PNA不能够主动穿过细胞膜及核膜进入细胞内。第12密码子特异性NLS-PNA对突变型细胞株生长抑制效果良好，对野生型细胞株生长无抑制作用。各组间早期凋亡未见显著差异。NLS-PNA作用后可显著降低突变型Panc-1细胞内源性Ras蛋白水平，下调Ras下游重要的信号分子Erkl/2和AKT蛋白磷酸化水平。结论：经NLS修饰PNA在两种细胞株中均具有良好而相同的穿膜和入核效率，并且能在低浓度下发挥更强更持久的K-ras基因抑制作用，具有显著抑制胰腺癌细胞生长，促进胰腺癌细胞凋亡，减少肿瘤新生血管形成的作用。.二、K-Ras靶向PNA抑制胰腺癌的动物实验研究.对Panc模型组进行局部注射与静脉注射干预，均能够有效抑制肿瘤生长再成瘤早期干预效果较成瘤后治疗更为显著。对野生型模型组效果不显著。Panc大鼠模型中，治疗组较对照组Ras基因表达受抑制，Ras蛋白合成减少，下调外周血及肿瘤部位VEGF、MMP-2、TNF-α的表达量。结论：直接瘤内注射方式与静脉注射相比，PNA能够更直接、更快速地在肿瘤部位富集。PNA不被血清及体液中的核酸酶及蛋白酶降解，能够到达靶基因部位发挥相应效应，而对于无靶基因的序列存在的细胞并无毒性作用，具有高特异性。无论瘤内给药抑或静脉给药，均能够在不同程度上抑制肿瘤细胞的生长，抑制K-ras基因的转录，下调Ras蛋白的合成，因此在一定程度上阻断了Ras参与的信号传导通路，减少了影响肿瘤新生血管形成及肿瘤转移的重要蛋白的表达。肿瘤发生初期进行干预，可有效地减缓肿瘤形成过程，降低肿瘤的侵袭性。.小结：体内、体外实验证实，NLS-PNA能够在一定程度上减缓肿瘤细胞的生长，减少微转移灶的形成，对胰腺癌的生长、侵袭和转移具有重要的抑制作用，瘤内给药与静脉给药相结合，能够达到最好的治疗效果。