N6-甲基腺苷通过P53信号通路参与砷诱导细胞恶性转化的机制研究

Arsenic-induced carcinogenesis has been extensively studied at the level of both DNA and proteins. However, the mechanisms remain to be elucidated. Recent studies have pointed that the epigenetic modifications of mRNA, which serves as a transducer between DNA and proteins, is associated with human diseases. Specifically, N6-methyladenosine (m6A) on mRNAs can modulate cell proliferation and apoptosis, and this appears to be associated with the P53 signaling pathway. Yet, it remains unknown if m6A on mRNAs is involved in arsenic carcinogenesis and if the level of m6A on the mRNAs of P53 signaling pathway may govern the development of arsenite carcinogenesis. In this project, employing human lung and skin cells, the target tissue of arsenic, we will initially determine the levels of m6A on mRNAs and activities of RNA methyltransferases (METTL3/METTL14/WTAP) and demethylases (FTO/ALKBH5) during arsenic-induced cell malignant transformation, to detect the effects of m6A on arsenic-induced malignant phenotypes. We will then specifically measure the level of m6A on the mRNA of p53 in malignantly transformed cells in comparison with that in untransformed control cells to determine if the m6A-mediated malignant transformation is dependent on the P53 signaling pathway. Our study is the first that explores the molecular mechanisms underlying arsenic carcinogenesis via the m6A-mediated P53 signaling pathway. Thus, the results will help to elucidate a novel role of m6A in the initiation and progression of arsenic carcinogenesis and further facilitate the development of new strategies for prevention and diagnosis of arsenic carcinogenesis.

无机砷的致癌机制尚未完全阐明，最近有研究提示mRNA上的N6-甲基腺苷（m6A）修饰可影响细胞的增殖和凋亡，并与P53信号通路有关。然而，m6A是否参与了砷诱导的肿瘤？是否通过影响P53信号通路参与砷诱导肿瘤的发生发展？如何影响？迄今均未见报道。项目将以砷致癌主要靶器官（肺和皮肤）来源的正常细胞作为研究对象，借助细胞恶性转化模型，首先检测mRNA上的m6A及其甲基转移酶和去甲基化酶在砷诱导细胞恶性转化过程中的变化规律，明确m6A是否参与砷诱导的细胞恶性转化；接着观察m6A水平变化对P53信号通路的影响，揭示P53通路特定信号分子mRNA上的m6A水平改变在砷诱导细胞恶性转化中的作用。本课题首次从RNA表观遗传学角度，解析m6A通过影响P53信号通路参与砷诱导细胞恶性转化的分子机制，研究结果有助于阐明m6A在砷诱导肿瘤发生发展中的作用，为m6A在肿瘤预防和诊断中潜在的生物学意义提供科学依据。

课题以砷致癌的主要靶器官（皮肤和肺）来源的正常细胞作为研究对象，借助细胞恶性转化模型，首先检测mRNA上的m6A及m6A甲基转移酶和去甲基化酶在砷诱导细胞恶性转化过程中的变化规律，明确m6A是否参与砷诱导的细胞恶性转化；接着观察m6A水平变化对p53蛋白的影响，揭示p53分子及p53通路的关键分子mRNA上的m6A水平改变在砷诱导细胞恶性转化中的作用。主要结果如下：（1）随着砷处理代数的增加，m6A水平逐渐增加，m6A甲基化酶 (METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429) 和结合蛋白 (YTHDF1) mRNA和蛋白水平也逐渐增加，而m6A去甲基化酶 (FTO) 的蛋白表达水平逐渐降低。（2）干扰m6A甲基化酶METTL3后HaCaT-T细胞m6A水平明显降低。随后，通过MTT法、流式细胞术和划痕实验检测，我们发现，干扰METTL3后HaCaT-T细胞对亚砷酸钠的抵抗能力明显下降，表现为活力降低、凋亡率升高，且迁移能力降低。（3）我们从p53突变、表达和活性三个方面检测并分析了砷诱导细胞转化过程中m6A调控p53的作用。发现m6A通过抑制p53活性而不是p53表达参与砷诱导皮肤细胞转化以及皮肤癌的发生发展过程，再次说明p53在癌症发生发展中的重要作用。（4）通过翔实先进的分子生物学实验和精细入微的生物信息学分析，我们发现p53正性调控因子PRDM2、p53负性调控因子MDM2和YY1是参与调控m6A抑制p53活性的关键分子，MeRIP-RT-qPCR检测证实三个关键分子的转录本上存在多个m6A修饰位点。我们的实验和分析结果说明，m6A通过降低p53正性调控因子PRDM2的表达、增加p53负性调控因子MDM2和YY1的表达，抑制了p53活性，介导了砷诱导的细胞转化和皮肤癌生成。我们的研究揭示了m6A介导的亚砷酸盐诱导人角质形成细胞转化的机制，为亚砷酸盐诱导细胞转化和癌变过程中p53活化改变的复杂机制研究提供了新思路。.此外，除了完成研究课题的全部内容，课题组还增加了m6A与砷诱导氧化应激的研究，发现氧化应激可能是砷诱导m6A水平升高的关键因素。而且，我们研究了项目中没有计划的m6A调控miRNAs和lncRNAs在砷诱导细胞转化中的作用，以及“砷诱导皮肤癌症生成中m6A的调控网络”。研究达到了预期目标!