一株新的马乳酒样乳杆菌高产胞外多糖的分子机制研究

Nowdays the safety of dairy products of China is threatened by the excessive addition of thickner and stabilizer. While the same products abroad use the EPS from viscosity-producing lactic acid bacteria strains (LAB) to get viscosity and stability to make sure the tasty and quality. Hence, to research and development of LAB EPS is paramount necessity..A total of 12 strains have been isolated from Tibet kefir by our group, all of which have been proved to have the ability to produce EPS. Among the strains, L.kefiranofaciens is potentially useful in diary industry, as EPS have relatively better rheology characteristics. The EPS yield reached up to 1518mg/L, which is in higher level in the present report, so the strain is a good test model for the study of high yield EPS key genes..This project intends to build the L.kefiranofaciens mutants library by using the phage Mµ DNA transposition complexes which randomly insert L.kefiranofaciens genome, to get mutons by phenotype selecting; to get the target gene sequence by TAIL-PCR and comparing with complete genome sequence, and to analyze its biology information; to verify the target gene function by constructing gene-knockout strains, over-express strains and genetic complementary experiments. This project will preliminary clarify the molecular mechanism of high EPS production of L.kefiranofaciens.

目前乳制品中过量增稠剂和稳定剂的添加严重威胁着我国乳制品的安全性，而国外同类产品则多以产粘乳酸菌的EPS来赋予发酵乳制品粘度和稳定性，以保证产品的口感和质量，故对乳酸菌EPS的研究和开发尤为必要。课题组已从西藏开菲尔粒中分离得到12株产EPS乳酸菌，其中马乳酒样乳杆菌EPS具有良好的流变学特性，在乳制品行业中有较高的应用价值。该菌株EPS产量达到1518 mg/L，在已知报道中处于较高水平，可作为研究乳酸菌高产EPS关键基因的良好实验对象。本研究拟利用人工转座复合物随机插入马乳酒样乳杆菌基因组，构建转座子突变库；经表型筛选，获得EPS产量显著改变的突变子；使用染色体步移技术及与已知的全基因组序列比对，获得突变子转座插入位点两侧的DNA序列，进而获得基因全序列，并进行生物信息学解析；通过敲除试验、互补实验和超表达手段验证基因功能。本研究工作将初步阐明马乳酒样乳杆菌高产EPS的分子作用机制。

项目以具有高产 EPS 的马乳酒样乳杆菌ZW3为出发菌株，通过Mμ转座技术获得了一株突变株2#，苯酚-硫酸法测其胞外多糖产量，发现同野生菌株ZW3相比EPS产量下降了40%。进一步分析突变株产糖量下降的原因，对突变株进行了重基因组测序，并与野生菌株进行了基因组比对发现，在 CDS 区和启动子区发生突变的基因共60个，其中对相关催化反应酶类的6个基因通过 Blast比对和 Pfam数据库分析预测功能，分别为：WANG_0173、WANG_0174、WANG_0175 （WANG_0173- WANG_0175都是编码二羟丙酮激酶或其亚基部分）、WANG_1108（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，STPK）、WANG_0292（β-半乳糖苷酶小亚基）、WANG_0840（UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸：D-谷氨酸 连接酶，MurD），其中WANG_0292发生了同义突变。通过RT-qPCR技术研究了突变基因的相对表达量，结果显示 WANG_1108与 WANG_0840 相对表达量下调程度明显，后续选择WANG_1108与 WANG_0840 进行基因功能研究。. 生物信息学分析 WANG_0840编码的蛋白无信号肽与跨膜结构域，属于非分泌性蛋白，蛋白二级结构由α螺旋、β折叠、无规卷曲组成。目的基因片段与质粒 pET28a连接后转至菌株 Escherichia coli BL21（DE3）中表达，IPTG诱导后， SDS-PAGE 蛋白电泳检测到重组子E.coli BL21（pET28a-ZW3/2#-0840）的目的条带，初步推测可能与产糖量有相关性。基因 WANG_1108 也无信号肽与跨膜结构域，与质粒 pET28a连接后转至菌株 Escherichia coli BL21（DE3）中表达，IPTG 诱导后 酶活测定结果显示，突变株中STPK酶活性浓度比野生菌降低了 37%，表明基因WANG_1108的突变是EPS产量降低的原因之一。. 项目初步阐明菌株高产胞外分子作用机制，将为通过遗传工程方法构建高产 EPS 的优良菌株打下理论基础。