非编码RNA BC1调控海马神经元突触生长在癫痫发生中的作用及机制研究

Hippocampal neuronal dendrites growth following status epilepticus, together with synaptic reconstruction, forms the basis for temporal lobe epilepsy pathophysiology. Recent study revealed that neuro-specific non-conding RNA BC1 had played an important role in dendrites' growth and formation of synaptic connections, and may be involved in epileptogenesis process. This program is to up-regulate the BC1 RNA expression in lithium-pilocarpine treated post status epilepticus rat hippocampus using lenti-viral siRNA technology, and to observe newborn hippocampal neuron's mature status, synaptic reconstruction and ultra-structures, neuronal electro-physiological feature and spontaneous attacks by confocal laser scanning microscopy, transmission electron microscope, patch clamp, molecular biology and morphology methods, so as to study the relationship between BC1 RNA and the abnormal hippocampal synaptic growth in epileptogenesis. The program is also aimed to observe BDNF expression and ERK pathway activation status, and by intervening BC1 gene expression within post status epilepticus rat hippocampus and specifically blocking the ERK pathway activation, it investigates possible molecular mechanism of synaptic reconstruction and epileptogenesis in which BC1 RNA regulates the BDNF expression and phosphorylation of ERK pathway before exerts influences on following synaptic growth and neuronal electro-physiological changes. Completion of this program will find new breakthroughs for the treatment of intractable epilepsy.

海马神经元树突异常生长、以及突触再生和重塑等，是难治性癫痫自发性发作的重要病生基础。新近研究发现神经系统特异性的非编码RNA BC1在神经元树突生长、突触联系形成中至关重要，可能参与了癫痫的发生发展。本项目拟应用慢病毒载体转染至氯化锂-皮罗卡品致痫大鼠海马神经元中上调BC1 RNA的表达，通过激光共聚焦显微镜、电镜、膜片钳、分子生物学和形态学方法，观察其对海马神经元成熟状态、突触生长重建、突触超微结构、神经元电生理特性、以及大鼠自发性癫痫发作的影响，研究BC1 RNA在致痫后海马神经元突触生长及癫痫发生中的作用；同时还将观察海马中BDNF表达和ERK通路激活的情况，并通过干预致痫后海马神经元内BC1基因的表达，以及特异性阻断ERK通路的磷酸化激活，探讨BC1 RNA影响BDNF表达、调控ERK通路的磷酸化，在突触生长重塑和癫痫发生中的可能作用机制，为难治性癫痫的治疗提供新的突破点。

本项目从海马神经元的突触异常生长、突触重塑在难治性癫痫发生中的重要意义为出发点，研究探讨了神经系统特异性非编码RNA BC1在致痫后海马神经发生、异常出芽过程中的表达变化和可能作用机制，发现其在癫痫持续状态后各时点上的海马组织中呈下调改变的动态表达变化，同时也观察到BC1 RNA可能的下游蛋白在致痫后各时点海马组织中具有表达的差异，并确证了BC1 RNA与重要的核转录因子eIF4A蛋白在致痫后的大鼠海马中具有RNA-蛋白之间的相互作用；通过基因过表达技术、病毒载体转染致痫大鼠海马神经元后，检测到突触蛋白PSD-95\Synaptophysin的表达上调、海马神经元树突棘的数目增多、树突棘内超微结构改变，并观察到了过表达BC1 RNA实验组的致痫大鼠在慢性期内的自发性癫痫发作的频率和强度均有显著减轻或改善，说明BC1 RNA表达改变对癫痫形成产生影响和作用；最后本项目还对BC1 RNA调控致痫后大鼠海马神经元的树突生长、突触重塑的分子机制进行了初步探讨，在BC1 RNA下游众多的可能靶点中，发现BC1 RNA作为重要的负向调控子，可影响GRK5蛋白表达、继而通过GRK5调控了致痫后海马中神经发生相关的MAP-2\Ki67及Tuj-1蛋白表达，并通过实验进一步证实了GRK5蛋白与微管相关蛋白MAP-2在致痫后的大鼠海马中具有蛋白-蛋白之间的相互作用，由此推测BC1作为神经系统特异性的非编码RNA，可通过调控下游分子如GRK5\MAP-2蛋白等，在致痫后的大鼠海马神经重塑、癫痫形成中具有调控功能和作用。.课题组已基本完成本项目预计研究计划，并取得了诸多研究成果，本项目将为癫痫发病机制研究的深入和拓展提供一种新的思路，为非编码RNA在癫痫致病机理中的探索提供新的研究基础；以BC1 RNA为突破点，研究表观遗传学在癫痫发生中的作用和功能，探讨新的重要的表观遗传学因素在癫痫形成中的影响，为从更高层面深入探究致痫后海马神经发生和突触重塑在难治性癫痫中的作用奠定坚实的理论基础，为难治性癫痫的治疗提供新的突破点。