小鼠完全生长卵母细胞耐受DNA双链断裂损伤的分子机制研究

DNA damage is one of the most common insults that challenge cells. When the extent of DNA damage exceeded repair capacity of the cell, apoptosis will initiate to maintain the stability of the genome. Our previous results found that fully grown mouse oocyte with serious DSBs didn’t initiate apoptosis, and they did resume meiosis, which indicated the absence of DNA damage checkpoint. The molecular mechanism of this particular phenomenon has not been clarified. In this study, we will comprehensively check apoptosis events; completely analyze p53 pathway which is the major pathway in DDR and do research on the effects of special chromatin structure in GV stage on oocyte apoptosis, so as to clarify the molecular mechanism of tolerance of DSBs in fully grown oocyte. Further more, DNA damage response after GV stage in oocyte will also be studied to determine the time when DNA damage checkpoint is reestablished. Germ cells bear the responsibility of passing genetic material to next generation, so its genome stability determines the reproductive ability of individuals and species reproduction. Therefore the research on DNA damage in germ cells is of great important theoretical and practical significance. The results of this project will disclose the variation of DNA damage response in oocyte in different stages; it is meaningful to improve the basic theory of reproductive biology. At the time, it can be referenced for the research about the effect of cancer chemotherapy and radiotherapy on female reproductive capacity.

DNA损伤是细胞面临的常见威胁之一，当遭受严重DNA损伤时细胞将启动凋亡程序，维护基因组稳定性。我们的前期研究发现小鼠完全生长卵母细胞在遭受严重DSBs损伤时，不仅不发生凋亡，而且能够恢复减数分裂，表现为DNA损伤检验点缺失。这种特殊现象的分子机制尚不明确。本研究将全面检测严重DSBs卵母细胞凋亡分子事件的发生情况、完整分析DDR主要通路——p53通路的应答状况、研究GV期特殊染色质构象对卵母细胞凋亡发生的影响，以阐明完全生长卵母细胞耐受严重DSBs的分子机理。进一步分析GV期后卵母细胞的DNA损伤应答，确定GV期后DNA损伤检验点重建的时间。生殖细胞承担着遗传物质传递的重任，其基因组稳定性决定了个体生殖和物种繁衍的能力，因此对生殖细胞DNA损伤的研究具有重要理论和现实意义。本项目的研究结果将完善不同阶段卵母细胞DNA损伤应答的变化规律，对癌症放化疗影响女性生殖能力的研究具有借鉴作用。

p53通路是细胞内DDR的主要通路，具有调控DNA损伤修复、细胞周期阻滞、凋亡等生物学功能。我们研究发现体外卵母细胞遭受严重DSBs 1-12h都没有发生凋亡，因此我们进一步分析了卵母细胞内的p53通路。结果发现完全生长的卵母细胞表达p53基因，p53蛋白定位于卵母细胞的生发泡内。严重DSBs后p53蛋白的上游激酶Chk1和Chk2能够被激活，而p53下游调控基因的表达并没有显著升高，而且细胞色素C并没有从线粒体内释放出来，说明卵母细胞内的p53通路被阻断。进一步研究发现卵母细胞内含有p53K376 (Ac)凋亡调控位点的p53a型mRNA的相对表达丰度显著低于颗粒细胞，严重DSBs后p53S20的磷酸化缺失，提示卵母细胞内p53的激活受到影响，这是p53通路被阻断的主要原因。过表达p53下游调控基因Bax能部分补充卵母细胞内的p53通路功能，有限诱导卵母细胞凋亡。体内研究则发现完全生长的卵母细胞发生DSBs后发生早熟，并伴有凋亡趋势。表现为在没有hCG处理的情况下就恢复减数分裂，进入分裂期，开始纺锤体组装，但是组装的纺锤体极其紊乱，其中一部分甚至排出了类似第一极体的结构。同时这些卵母细胞还表现为细胞质皱缩、变黑，卵周隙增大，染色体凝聚、细胞核固缩，胞质内和凝聚的染色体上均可检测到活化Caspase 3的信号，这种卵母细胞的比率在DSBs组显著上升。此外，我们还发现CK2激酶通过调控PI3K/AKT通路和DNA损伤反应参与卵母细胞凋亡的调控。条件性敲除CK2β基因导致卵母细胞凋亡与卵泡闭锁，从而导致卵巢早衰。PI3K / AKT信号通路被抑制，AKT磷酸化水平降低(S473, T308, S129)，CK2β敲除小鼠卵母细胞DSBs增加，激活chk2依赖性p53通路。