中红侧沟茧蜂免疫的分子机制研究

Parasitoid wasps are natural enemies of insect hosts in natural ecosystems, and they play important roles in management of agricultural pests as biological control agents. Improving their biocompatibility, immunity, and longevity will improve the effectiveness of integrative pest management practices. However, few studies have focused on the hymenopteran insect immunity in response to foreign biostress factors. In this research, we will analyze the transcriptome of a braconid wasp, Microplitis mediator, infected by various pathogenic fungus (Beauveria bassiana), entomopathogenic bacteria (Enterobacter cloacae, Micrococcus luteus) together with different developmental stages, respectively by using high-throughput sequencing technique. Firstly, the de novo assembly will be carried out of different libraries from M. mediator. Afterwards, the immune-related molecules will be annotated based on sequence similarity to homologues known to participate in immune responses in other insect models. Secondly, differential expressed gene repertoire will be analyzed as well as the implication of Toll, IMD pathways and melanization genes involved in the immunity will be revealed. Finally, we use RNA interference to knockout Toll pathway inhibitor Cactus and other key immune genes to compare survival curves, and the parasitism rate cotton bollworm, Helicoverpa armigera, its suitable host. Our study, as the first genome-wide analysis of Microplitis immunity, will establish a framework of Microplitis immunity and also provide valuable information to increase the ecological and environmental adaptation by parasitoid wasps.

寄生蜂是生物防治鳞翅目害虫的天敌昆虫，研究提高其生物适应性和免疫力对增强控害效能具有重要意义。目前国内外关于膜翅目昆虫自身免疫系统的研究还不够深入。本项目拟利用高通量测序技术，针对不同发育阶段以及受不同外源病原物侵染的寄生蜂进行转录组测序，研究揭示中红侧沟茧蜂对外源生物胁迫物适应的免疫机制。首先完成茧蜂序列从头拼接，通过同源基因比对注释主要免疫因子；其次，构建差异基因表达图谱，明确免疫途径中的关键分子，并揭示不同感染及各发育阶段主要免疫信号通路Toll，IMD及黑化反应途径的激活情况；最后，RNA敲除Toll途径抑制因子Cactus和其他筛选到的关键基因，比较干扰前后生存曲线和对棉铃虫寄生率等表型变化，阐明寄生蜂免疫的分子机制，寻找膜翅目昆虫特异的免疫通路，并探索寄生蜂免疫调节与繁殖生长之间的调控关系。这些研究有助于深入理解寄生蜂免疫的分子机理，为充分利用中红侧沟茧蜂开展生物防治提供指导。

中红侧沟茧蜂是寄主非常广泛的容性内寄生蜂，在生物防治中发挥重要作用。近年来受田间环境因素影响，寄生蜂在自然条件下难以连续传代，致使寄生蜂的防治规模无法扩大。增强寄生蜂的生物相容性，免疫力和繁殖力，可有效提高寄生蜂的防治效率。然而，对中红侧沟茧蜂免疫系统的研究甚少。本课题利用革兰氏阴性菌阴沟肠杆菌，革兰氏阳性菌藤黄微球菌，和真菌球孢白僵菌感染羽化当天的中红侧沟茧蜂雌蜂，同时采集各发育阶段的幼蜂和蛹，进行高通量转录组测序，运用生物信息学方法共注释到112个先天免疫相关基因，包括识别分子、信号分子、调控分子和效应分子等。通过与其他昆虫物种免疫基因的同源比对，中红侧沟茧蜂的免疫分子数目较少，仅为双翅目昆虫的1/3，鞘翅目及鳞翅目昆虫的1/2。免疫基因的数量较低主要归因于较少的C型凝集素，丝氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋白酶抑制剂和抗菌肽基因。肽聚糖识别蛋白(PGRP)是重要的模式识别受体，从中红侧沟茧蜂转录组中鉴定得到6个PGRP基因。为了解析PGRP在寄生蜂中的免疫功能，我们构建了系统进化树，并分析了它们在不同外源病原体刺激及不同发育阶段的基因表达谱。由于MmePGRP-S1在真菌和细菌免疫下均有显著升高，为了进一步明确其功能，对MmePGRP-S1进行双链RNA干扰，并以不同的病原物进行免疫刺激，在革兰氏阳性菌的感染下，存活率有显著的差异，表明MmePGRP-S1在抵御革兰氏阳性菌的反应中起重要作用。中红侧沟茧蜂中存在一类特殊的免疫基因，该免疫因子特化成寄生因子（VRF），使用酵母双杂交和GST pull-down验证了VRF1能够与寄主棉铃虫的转录因子Dorsal相互作用，寄生后寄主的Dorsal发生剪切，寄主的Toll通路的级联反应受到抑制，相关抗菌肽的表达量下降，致使寄生蜂在寄生早期对寄主的免疫系统具有明显的抑制作用。本研究不但可以增加人们对膜翅目昆虫自身免疫系统的认识，同时有助于寻找针对寄主而不影响寄生蜂的环境友好型杀虫剂，为合理利用外源生物开展害虫的生物防治提供一定的理论基础。