自噬在移植后脂肪干细胞存活和成脂中的作用及机制研究

Ischemia and hypoxia is the main reason for low fat survival after autologous transplantation. Since autophagy plays an important role in maintaining the cells survival under the condition of hypoxia and ischemia. Study has confirmed that autophagy can promote adipose stem cells adipogenesis under physiological state. However, it is not clear whether autophagy plays a regulatory role of adipose stem cells under microenvironment of hypoxia and ischemia. Our previous studies suggested that transplanted adipose stem cells promote angiogenesis, a moderate autophagy promoting endothelial progenitor cell survival under the condition of hypoxia and ischemia. And we found that body fat cells autophagic levels significantly increased early stage in vitro. Under the condition of hypoxia and ischemia, the intracellular ATP/AMP ratio decreased, AMP-activated protein kinase (AMPK) enhanced cell autophagy by inhibiting the activity of mTOR. Our team will study the survival, adipogenic and angiogenesis of autophagy on adipose stem cells in vitro and vivo under ischemia and hypoxia. And then explore the regulation of AMPK-mTOR pathway for adipose stem cell autophagy by AMPK or mTOR respectively and interaction between them. The goal is to promote new ways of higher percent survival of adipose stem cells, adipogenic and angiogenesis.

缺血缺氧是导致移植后自体脂肪低存活的主要原因。自噬在维持缺血缺氧状态下细胞的存活中起重要作用。研究证实自噬可以促进生理状态下脂肪干细胞的成脂作用，但自噬能否对移植早期缺血缺氧微环境下的脂肪干细胞发挥调节作用并不清楚。课题组前期研究提示移植的脂肪干细胞促进血管新生，适度的自噬促进缺氧状态下血管内皮祖细胞存活，并在预实验中发现离体脂肪细胞早期自噬水平明显提高。缺血缺氧状态下，细胞内ATP/AMP比值降低，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通过抑制mTOR的活性使细胞自噬增强。课题组将研究体外缺血缺氧状态下及体内移植早期自噬对脂肪干细胞存活、成脂及成血管的作用，然后通过分别研究AMPK和mTOR对自噬的调控作用以及AMPK和mTOR的相互作用，明确AMPK-mTOR通路对缺血缺氧状态下脂肪干细胞自噬的调控作用。最终目标是探索移植过程中提高脂肪干细胞存活、成脂及促血管发生的新方法。

缺血是移植后自体脂肪吸收率高的主要原因之一。自噬使细胞在饥饿状态下提供能量生存。如果脂肪来源的干细胞（ADSCs）提前从组织中去除，移植的脂肪组织通常不能长期存活。因此，探讨ADSCs在移植微环境中的生存和分化机制具有重要意义。本项目研究内容主要为脂肪干细胞移植后是否存在保护性自噬现象以及自噬是如何被调控的。一：我们探讨了雷帕霉素通过调节自噬参与缺血对脂肪干细胞生存和成脂的影响。慢病毒载体转染细胞的RNA干扰微管相关蛋白3基因降低自噬或雷帕霉素提高自噬。细胞暴露于氧糖剥夺（OGD）模拟缺血微环境。检测细胞自噬，凋亡和分化。shRNA-LC3和雷帕霉素处理能有效降低和改善在OGD中细胞自噬水平。此外，抑制自噬可以增加细胞凋亡和激活caspase-3的表达率，这些都是雷帕霉素预处理的结果。在脂肪细胞分化过程中，抑制自噬不仅降低油滴的积累而且降低脂蛋白脂酶和过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达。雷帕霉素促进自噬增加了油滴的积累和LPL和PPARγ的表达。雷帕霉素可能通过上调自噬促进缺血脂肪细胞存活和成脂。二：AMPK已被证明是调节细胞代谢的能量受体之一。AMPK的激活与成人缺血性损伤模型有关，但AMPK对移植ADSC的存活和脂肪生成的机制和调节作用尚不清楚。我们采用缺氧-葡萄糖剥夺（OGD）模拟移植微环境，检测ADSCs的存活和脂肪生成。我们发现OGD治疗触发了显著的细胞凋亡并促进自噬。同时，OGD阻碍了脂肪干细胞向成熟脂肪细胞的分化。抑制AMPK后，OGD诱导的细胞凋亡率增加，但自噬受到抑制，脂肪生成水平也降低。为了证明AMPK对细胞凋亡和脂肪生成的作用是自噬依赖性的，我们在阻断AMPK的同时用雷帕霉素促进自噬。我们发现，改善自噬有效地逆转AMPK抑制剂在细胞凋亡和脂肪生成中的作用。此外，我们还发现，抑制AMPK显著促进mTOR活性。我们的研究表明，AMPK可通过正向调节自噬作用在维持OGD环境下ADSC的存活和脂肪生成中起保护作用。AMPK通过抑制OGD条件下的mTOR活性而积极调节自噬。