ROS介导的NALP3炎性体信号通路活化在腰椎软骨终板退变中的作用和机制

The degeneration of lumbar cartilage endplate is an important reason of low back pain and the intervertebral disc degeneration. Literature have reported the inflammatory cytokines may play an important role in the occurrence and development of the lumbar cartilage endplate degeneration, however, the exact molecular mechanisms have not been studied. Reactive oxygen species ( ROS ), the pro-inflammatory cytokines IL-1β and IL-18, have been proved to be the important reasons of the articular cartilage degeneration, and the latest research in macrophage, found that, through thioredoxin interacting protein (TXNIP), ROS can activate the NALP3 inflammasome, then stimulate the caspase-1, promote the secretion of IL-1β and IL-18, and trigger excessive inflammatory response. Our preliminary research have showed the level of ROS, and the protein expression of NALP3, caspase-1, IL-1β and IL-18 were significantly increased in degenerative lumbar cartilage endplate. So,this project will analyze the effect of NALP3 inflammasome signaling pathway activated by ROS in lumbar cartilage endplate degeneration, and investigate how TXNIP modulates this signaling pathway, through human lumbar endplate cartilage specimens; and mouse lumbar endplate cartilage cells affected by H2O2 in vitro, treated by antioxidation, NALP3 and TXNIP gene silencing and overexpression. The object is to provide a theoretical basis for developing new treatments of lumbar cartilage endplate degeneration.

腰椎软骨终板退变是引起腰痛和腰椎间盘退变的重要原因，研究发现炎性因子可能在其发生发展中发挥重要作用，但确切的分子机制尚不清楚。活性氧（ROS）、促炎症因子IL-1β和IL-18已被证实是引起关节软骨退变的重要原因；巨噬细胞研究发现ROS通过硫氧还蛋白交互作用蛋白(TXNIP)激活NALP3炎性体，进而活化caspase-1，促进IL-1β和IL-18分泌，引发炎性级联反应。我们前期研究，发现ROS水平，NALP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表达在退变腰椎软骨终板中明显升高。因此本项目拟通过体内人腰椎软骨终板标本；体外小鼠腰椎软骨终板细胞培养，H2O2作用制备ROS细胞模型，通过抗氧化治疗，NALP3和TXNIP基因沉默和过表达模型；阐明ROS活化NALP3信号通路在腰椎软骨终板退变中的作用，揭示TXNIP对该通路的调控作用，最终为腰椎软骨终板退变的治疗提供新分子靶标。

腰椎软骨终板退变是引起腰痛和腰椎间盘退变的重要原因，文献研究认为炎性因子可能在其发生发展中发挥重要作用，但确切的分子机制尚不明了。活性氧（ROS）、IL-1β和IL-18已被证实是引起关节软骨退变的重要原因；体外研究又表明ROS激活NALP3炎性体，进而活化caspase-1，促进IL-1β和IL-18的分泌，引发炎性级联反应。.我们通过完善人腰椎软骨终板标本库，收集临床软骨终板标本行ROS测定，NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA和蛋白表达测定，分析ROS和NLRP3炎性体信号通路活化的相关性，及其在腰椎软骨终板退变中的可能作用。构建ROS细胞模型，分析ROS对NLRP3炎性体信号通路的活化作用，检测过氧化氢刺激后NLRP3、caspase-1、IL-1β通路表达情况。本课题中我们发现相较于创伤对照组，HE和番红O染色表明，发生Modic改变的软骨终板呈现纤维化，细胞外基质呈现降解改变，染色淡染，软骨细胞数目明显减少；软骨标志性基因二型胶原和SOX-9在Modic改变组中呈现下调趋势；而WB，RT-PCR和免疫组化结果提示炎性体通路NLRP3，caspase-1，IL-1β在Modic改变组中呈现明显表达上调。与脊柱创伤病人（MRI上没有退行性变信号）相比，下腰痛和Modic改变的病人软骨终板中NLRP3，caspase-1，IL-1β表达上调。我们的研究结果表明NLRP3，caspase-1，IL-1β通路轴或许在腰椎软骨终板退变中发挥作用。继而通过培养大鼠软骨终板原代细胞，本课题成功建立了软骨终板细胞的氧化损伤致软骨细胞退变模型，即1000 uM过氧化氢能够成功诱导软骨终板细胞氧化损伤导致退变，2mM NAC具有显著的挽救作用。过氧化氢诱导后NLRP3/Caspase-1/Interleukin-1b信号通路明显表达上调。为进一步研究相关机制，本课题采用了人和大鼠软骨终板标本两种不同体外模型，并成功在体外实验中验证了过氧化氢能够成功诱导软骨细胞氧化损伤，NAC清除氧化刺激后具有显著挽救效果；过氧化氢诱导后NLRP3/Caspase-1/Interleukin-1b信号通路明显表达上调。相同的实验结果在大鼠尾椎在体动物模型中得到验证，明确腰椎软骨终板中ROS活化NLRP3炎性体信号通路的作用和机制，为开发相关分子靶点药物治疗腰椎软骨终