枸骨三萜皂苷合成途径关键酶基因IcSS、IcSE的克隆及功能研究

Triterpenoid saponins are main secondary metabolites of Ilex cornuta and have important medicinal value. Squalene Synthase (SS) and squalene epoxide lyase (SE) are two key enzymes involved in the regulation of triterpene saponin biosynthesis，and the studies on molecular mechanism of triterpenoid saponins in Ilex cornuta have not been reported. The present study intends to take Ilex cornuta leaves as test materials, and confirm the regulatory effect of IcSS and IcSE on triterpenoid saponins biosynthesis through constructing the sense and antisense expression vector and transferring into Nicotiana tabacum. SS and SE cDNA and DNA sequences will be obtained by RACE PCR technologies from Ilex cornuta. The methods of Real-time PCR will be used to analyse the differential expression patterns of IcSS and IcSE. The results of gene expression pattern combining the changes in triterpenoid saponins content are to identify the correlation between them. In addition, the enzyme activity analysis of squalene synthase and squalene epoxidase will be carried out on prokaryotic expression products. At last, we would like to determine the gene expression levels of IcSS, IcSE and triterpene saponin content in transgenic tobacco, and investigate regulating function of IcSS and IcSE in triterpenoid saponins biosynthesis. The results of this study will provide the theory basis and gene resource for improving the content of triterpenoid saponins by genetic engineering technology in Ilex cornuta.

三萜皂苷是枸骨的主要次生代谢物，具有重要的药用价值。鲨烯合酶（SS）、鲨烯环氧酶（SE）是三萜皂苷合成途径的两个关键酶。目前，在其它植物上研究结果表明鲨烯合酶和鲨烯环氧酶可参与调控三萜皂苷的生物合成，而有关枸骨三萜皂苷代谢分子机理的研究尚未见报道。本研究拟以枸骨叶为试材，1.通过RACE技术获得枸骨SS和SE基因的cDNA和DNA序列。2. 利用实时定量PCR技术分析IcSS和IcSE基因在枸骨各组织部位的表达模式，结合三萜皂苷含量变化分析基因表达量和三萜皂苷含量的关系。3.通过原核表达产物酶活分析验证鲨烯合酶、鲨烯环氧酶的催化活性。4.构建IcSS和IcSE 基因正反义表达载体，通过转基因烟草中IcSS和IcSE基因表达水平和三萜皂苷含量的差异验证IcSS和IcSE基因调控三萜皂苷合成的功能。本研究结果可为利用基因工程技术提高枸骨三萜皂苷含量提供理论基础和基因资源。

枸骨为冬青科冬青属植物，常绿灌木或乔木，枸骨叶作为一种传统中药材，主要含有三萜及其皂苷等药用成分，因此具有重要的药用价值。本项目以枸骨为试材，采用RNA-seq技术挖掘了枸骨三萜皂苷合成代谢途径中的关键酶基因IcSS、IcSE1，通过功能验证分析了IcSS、IcSE1基因在枸骨三萜皂苷合成中的调控机制；克隆鉴定了枸骨三萜皂苷合成代谢过程中的重要酶基因IcSE2、IcFPS、IcDXS和IcCYP716A，初步分析了这些重要酶基因在枸骨三萜皂苷生物合成中的功能；筛选了枸骨不同组织、不同发育期枸骨叶、不同胁迫下枸骨叶中最适合的内参基因；建立了枸骨组织培养体系。主要研究成果如下：（1）筛选了枸骨三萜皂苷合成途径中的关键酶基因。采用RNA-seq技术分析了枸骨根、叶、果的转录组表达谱，采用HPLC技术测定了枸骨根、叶、果不同器官中三萜主要成分熊果酸和齐墩果酸含量，初步筛选了与三萜皂苷含量积累密切相关的差异表达基因，确定了枸骨三萜皂苷生物合成途径中的关键基因，积累了枸骨三萜皂苷合成代谢的大量基因资源。（2）克隆鉴定了枸骨IcSS、IcSE1基因，利用原核表达和酵母表达技术研究了IcSS、IcSE1基因的功能，初步弄清了IcSS、IcSE1基因在枸骨三萜皂苷合成中的调控机制。（3）克隆了枸骨三萜皂苷合成代谢过程中的重要酶因IcSE2、IcFPS、IcDXS和IcCYP716A，通过分析基因表达量和枸骨三萜含量的相关性，鉴定了关键酶基因调控枸骨三萜皂苷生物合成的分子机制。（4）筛选了枸骨的内参基因。利用BestKeeper、geNorm、NormFinder软件分析10个候选内参基因在枸骨不同组织，不同时期枸骨叶，不同胁迫处理下的枸骨叶片中表达水平的稳定性，筛选了枸骨不同组织，不同时期枸骨叶，以及不同胁迫下中最稳定、最合适的内参基因。（5）建立了枸骨组织培养体系：通过对外植体、消毒方法，以及培养基的筛选，获得了枸骨愈伤组织诱导的最适培养基为MS＋6-BA 2.5 μM+ 2,4-D 9 μM，初步建立了枸骨组织培养体系。该项目研究结果为进一步弄清枸骨三萜皂苷的合成代谢途径奠定了理论基础，为通过遗传改良有效增加枸骨中三萜类化合物的含量奠定基础，为通过生物工程、组织细胞工程来调控枸骨中三萜皂昔的生物合成提供一定的理论依据。