烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译机制的RNA结构基础解析

The 5'-m7GpppN cap structure plays a vital role to ensure the efficient translation by recruiting ribosomes to the 5' end of mRNA as well as cyclizing the mRNA. Plant positive-strand RNA viruses without 5' cap use nontraditional mechanisms to facilitate the translation. There are two dominating cap-independent strategies involving two types of RNA element, termed the 5' internal ribosome entry site (5' IRES) and the 3' cap-independent translation enhancer (3'CITE). The research hotspots of these two mechanisms were focused on the structural analysis of viral cis-elements and host factors recruited by these elements as well as the special interaction between viral RNA and host factor.In this project, cap-independent translation mechanism of Tobacco bushy top virus will be determined. By making use of reverse genetic methods and experimental RNA structural probing assay such as In-line probing and SHAPE, the core cis-elements will be mapped and analyzed structurally. The viral cis-element fused with strepto-tag will be used to isolate the host factors with high affinity, which will be analyzed by mass spectrum and determined by Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). The binding regions of specific host factor on viral genome will be determined by using EMSA and In-line probing assay. The RNA conformational shift caused by the binding of host factors will also be assayed. Finally,the goal of this project is to identify the type of cap-independent tranaltion of TBTV as well as its strcutural basis, meanwhile to create the RNA structural probing system in vitro, which is currently defective within the field of plant RNA virus in China.

mRNA 的5'帽子在蛋白翻译起始调控中至关重要。对于缺乏5'帽子的植物正单链RNA病毒而言，不依赖帽子的翻译起始机制主要有2类：分别由5'核糖体内部起始位点（IRES）和3'不依赖帽子的翻译增强子（CITE）介导。本课题以烟草丛顶病毒（TBTV）为研究对象，利用反向遗传学方法和RNA结构的体外实验分析体系，分析其不依赖帽子翻译所涉及的顺式调控元件的序列及结构；利用Strepto-tag融合型RNA的亲和层析技术和凝胶阻滞分析（EMSA）提取并确认与病毒的顺式调控元件存在特异性互作的特定宿主翻译元件，然后分析该翻译元件在病毒基因组上的结合区域及其结合前后病毒基因组相应区域的RNA构象变化。通过本课题的开展，确定TBTV的不依赖帽子翻译机制类型并完成其RNA结构基础的解析；同时改变我国植物RNA病毒的基因表达调控研究中缺乏RNA结构体外分析体系的现状。

以烟草丛顶病毒（TBTV）为对象开展不依赖帽子翻译机制调控研究，包括BTE元件核心结构特征分析、BTE结构进化与TBTV不同分离物p35蛋白表达差异的关系，TBTV中第二个不依赖帽子翻译元件的发现。.利用In-line probing技术解析了TBTV中BTE元件的结构特征，并利用萤火虫荧光素酶报告基因系统分析了BTE核心组件的调控作用，明确了BTE调控翻译的3方面核心特征： SL-I 17 nt保守序列；SL-III A与5’UTR形成远距离RNA-RNA互作；BTE的结构稳定性。然后在TBTV全长RNA表达p35蛋白的体外翻译体系和烟草原生质体的体内复制体系中进行了突变验证。.新克隆3个TBTV分离物，3个TBTV新分离物在烟草原生质体中 RNA积累量是野生型的30 %-40 %；而p35蛋白表达量是野生型的20 %-38 %，暗示TBTV新分离物弱致病力可能与p35表达量降低相关。利用嵌合病毒体外翻译实验定位了造成TBTV不同分离物p35差异表达的区域：RI区（基因组5’端的500 nt)和包含BTE的RV 区（3’端的3 138 位到3 885 位）。对于RV区而言，新分离物中BTE内部点突变不影响p35表达，而BTE区域外存在降低p35表达的突变U3580→A3580。SHAPE分析发现TBTV弱毒分离物及RV嵌合病毒的BTE区域均发生明显结构变化。说明BTE结构变异是导致TBTV弱毒分离物p35蛋白表达降低的分子基础，且BTE结构变异由BTE区域外突变造成。RI区降低p35蛋白表达的机制是潜在突变造成5’端的局部结构变化，抑制5’UTR与BTE SL-III A形成远距离RNA互作。.TBTV 3’UTR区域的系列缺失实验发现D9（△4040-4099）或D10（△4093-4152）会明显降低p35蛋白表达，且SHAPE技术分析D9和D10缺失突变没有影响BTE元件的活性结构。In line-proing技术分析4003-4152独立结构域包含5个发夹结构和3个假节点。此结构与TCV 3’UTR 的TSS结构类似。反式竞争实验证明此区域对翻译的调控作用。TBTV 存在除BTE之外的第二个不依赖帽子翻译调控元件。.本研究表明TBTV中至少存在2种不依赖帽子翻译元件，其中BTE结构进化是首次关于不依赖帽子翻译元件在特定RNA病毒不同分离物间结构进化的报道。