施氏假单胞菌ACC脱氨酶基因acdS表达调控机制研究

1-Aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase breaks down ACC, an immediate precursor of ethylene, to ammonia and alpha-ketobutyrate, which can be further metabolized by bacteria for their growth. . The presence of ACC deaminase activity in nitrogen-fixing Pseudomonas stutzeri A1501 have been reported.However, the regulation mechanism of ACC deaminase has not been performed. In this study, the proposed regulation mechanism of ACC deaminase in P. stutzeri A1501 was investigated. We will employ the following research: 1) To define the regulatory model for acdS expression by qRT-PCR and EMSA; 2)To explore the cooperation mechanism of AcdR and AcdB in acdS expression by yeast two-hybrid system and Co-Immunoprecipitation; 3) To define the molecular mechanism of acdS by protein-DNA interaction. This work will lay an important theoretical foundation for revealing the molecular mechanism of associate nitrogen–fixing microbial ACC deaminase expression.

ACC脱氨酶能将乙烯合成前体ACC分解为α-酮丁酸和氨，从而提高植物在逆境胁迫下的适应能力。虽然在少数菌内，ACC脱氨酶编码基因acdS基因表达调控机制比较明确，但是在不同菌内其机制相差甚远，因此ACC脱氨酶调控机制的深入研究对含ACC脱氨酶的植物促生菌在农业及环境治理中的应用至关重要。根据国内外现有研究及本实验室前期研究结果推测，RpoS蛋白通过AcdR和AcdB蛋白参与acdS基因的表达调控。本研究以施氏假单胞菌内acdS的表达调控机制为研究对象，开展以下工作：1）实时定量及凝胶阻滞实验明确acdS的表达模式；2）酵母双杂交和免疫共沉淀技术研究AcdR与AcdB的相互作用；3）蛋白-DNA互作技术研究RpoS蛋白对acdS的调控作用。本研究将为植物促生菌acdS调控机制的深入研究奠定重要的理论基础，同时也为抗逆微生物和高效促生菌的分子改造提供了理论依据。

施氏假单胞菌A1501是一株优良的PGPR菌，该菌分离自我国南方水稻根际土壤；除具有生物固氮能力外、还能进行反硝化及分泌IAA（0.0097 μg/mL）， GA（0.0315 μg/mL）等植物生长激素。施氏假单胞菌A1501基因组内存在ACC脱氨酶编码acdS基因，并且acdS基因参与了在盐胁迫、重金属等逆境条件下，施氏假单胞菌 A1501菌体存活及其对水稻的促生作用。目前，施氏假单胞菌A1501中 acdS基因表达调控机制尚不明确。ACC脱氨酶调控机制的深入研究对含ACC脱氨酶的植物促生菌在农业及环境治理中的应用至关重要。本研究项目通过对实施假单胞菌A1501中ACC脱氨酶编码基因acdS的调控机制进行深入分析，取得如下研究进展：rpoS或acdS基因突变后，在正常条件下，生长及固氮能力不受影响，但是在高盐条件下，固氮能力和存活能力与野生型相比有明显下降，且两株突变株的表型一致。通过生物信息学、荧光实时定量实验及凝胶组织实验证实RpoS蛋白能够识别基因启动子区域-10保守序列CXAXXXT。本项目在ACC脱氨酶调控基因acdR上游发现该保守序列；实时定量PCR显示在含有0.8 M NaCl的条件下，rpoS基因突变后ACC脱氨酶调控基因acdR表达量下调2.69倍。凝胶阻滞结果显示RpoS蛋白能够特异性结合在acdR启动子区域，表明RpoS蛋白可以通过ACC脱氨酶调控基因acdR基因调控ACC脱氨酶的表达。本研究将为联合固氮菌acdS基因调控机制的深入研究奠定工作基础，同时也为揭示根际微生物与宿主植物之间相互作用机制提供重要的理论依据。