用于抗癌天然产物Terrequinone A酶促全合成的多酶系统高效固定化机制研究

针对天然产物植物提取和化学合成时的诸多问题，以及游离酶串联催化或细胞催化时效率低或产物复杂等现状，提出基于"代谢区室"和"代谢槽"效应机制的多酶系统固定化设想，以抗癌天然产物Terrequinone A合成酶系为模式酶系统，在低温下微波辅助固定单酶基础上，借助二元固定方式制备固定化多酶系统，在胶囊载体内构建人工"代谢区室"，营造"代谢槽"效应，并将固定化多酶系统用于上述天然产物酶法全合成。探索低温下微波辐射对酶蛋白结构的改变规律，揭示微波"非热效应"对酶蛋白结构的作用机理；探索单酶催化动力学性能及比例等对固定化多酶系统催化效率的影响规律，阐明载体中多酶间的代谢区室、代谢槽效应作用机制以及固定化多酶系统性能优化机制有着重要意义。借助本项目研究形成具有自主知识产权的多酶固定化集成新技术，进一步丰富多酶系统固定化的基础理论研究，并为天然产物酶法高效全合成及体外合成生物学的发展提供了思路。

为了实现高效的多酶固定化，在发展单酶固定化方法的基础上，通过二元固定化技术制备多酶胶囊，构建代谢槽效应以实现固定化化多酶系统的高效催化。首先，项目中实现了Terrequinone A的游离酶催化全合成，通过巢式PCR等技术手段克隆构巢曲霉中Terrequinone A合成酶系基因并表达得到合成酶(TdiA. TdiB. TdiC. TdiD. TdiE)。利用TdiD在溶液中将L-色氨酸转化成IPA，TdiA催化IPA合成Terrequinone A中间体Didemethylasterriquinone D，并将二者与TdiB、TdiC、TdiE组合催化L-色氨酸合成得到了终产物Terrequinone A，实现了Terrequinone A的游离酶催化全合成。其次，建立微波辅助固定化方法，以分子量较小的醛缩酶和嗜热菌蛋白酶作为模式酶，微波辐射3min时间后，90%左右的醛缩酶被固定化于载体中，固定化酶相对活力达到149.2%。以3M NaCl增溶嗜热菌蛋白酶，40W微波辐射下负载率为93.2%；固定化酶相对活力为160.0%，是常规方法的4.5倍，固定化时间仅3 min。另外，建立基于非天然氨基酸定位的酶共价固定化方法，依据“死码活用”原理并结合定点突变方法，在酶蛋白结构中掺入非天然氨基酸，按照生物正交方式制备共价固定化酶。目前末端甲酰甘氨酸修饰的脂肪酶已成功表达并验证，固定化醛基脂肪酶催化效率值约为常规固定化酶的3倍，这验证了普通方法中错误连接会导致活性中心破坏或被掩埋从而引起催化性能下降的判断，此项工作继续进行中。最后，建立基于代谢槽效应的多酶固定化和催化方法。在单酶固定化方法建立的基础上，根据TdiA和TdiD的大小和催化顺序的不同，将TdiD固定化介孔泡沫硅载体中，将分子量大的TdiA（约100Kda）固定化于接枝的海藻酸上，并将二者混合并注射于CaCl2溶液中成型，制备了用于连续催化合成Didemethylasterriquinone D的固定化酶胶囊，该胶囊催化中相对于固定化TdiD和固定化TdiA单独催化展示了较好的催化效果，充分体现了代谢槽效应。同时，为了拓展多酶固定化技术的工业应用，利用上述方法将酸性磷酸酶、三磷酸甘油醛变构酶以及醛缩酶共同固定化形成胶囊，催化制备2-脱氧-D-核糖，以实现该医药中间体的多酶催化合成和绿色制备，此项工作继续进行中。