番茄果实成熟相关Dicer-like 2c的调控机制研究

Due to serious loss of fruits at home and abroad each year, it is important theoretical and practical significance to launch the research on the mechanism of fruit ripening and senescence. Tomato is an important horticultural crops and a model plant for the research in fleshy fruit ripening, our previous study shows that SlDCL2c expression is related to tomato fruit ripening, which is responsible for the biosynthesis of small RNA. This project aims to carry out in-depth research on SlDCL2c, and to illustrate biological function and regulation pathway of SlDCL2c in tomato fruit ripening by the methods of transgenic, RNA-seq, Small RNA-seq and so on; to verify biological rule of identification and processing of small RNA precursors by SlDCL2c at the biochemical level via the technologies of transient expression, Co-IP, in vitro reconstruction and so on; finally to clarify the molecular mechanism of SlDCL2c regulation on fruit ripening, which will provide new gene resource and new way for fruit ripening regulation.

针对每年国内外果品采后损失严重的实际问题，开展果实成熟衰老机制研究具有重要的理论和实际意义。番茄是重要的园艺作物和研究果实成熟的模式植物，课题组前期研究表明small RNA合成中重要核酸酶SlDCL2c的表达与番茄果实成熟相关。本项目拟对SlDCL2c开展深入研究，通过转基因、RNA-seq和Small RNA-seq等技术，解析SlDCL2c在番茄果实成熟中的生物功能及作用途径；利用瞬时表达、Co-IP和体外重建等手段，在生化水平上探明SlDCL2c识别和加工果实成熟相关small RNA前体的生物学规律；最终准确而清晰的诠释SlDCL2c调控果实成熟的分子机制，为果实发育成熟调控提供新的基因资源，为改造番茄果实性状提供新的途径。

小RNA在RNA沉默中扮演不可或缺的作用，它们的生成需要借助Dicer蛋白的加工。Dicer是一种核酸内切酶，在植物中被称作Dicer-like（DCL）。番茄中有四类DCL蛋白：DCL1-DCL4，其中DCL1、DCL3与DCL4的研究较为透彻。DCL2有四个成员：DCL2a、2b、2c与2d，DCL2b在番茄不同组织中表达含量最高。本项目在前期研究的基础上，利用转录组学、分子生物学技术及生化技术研究DCL2b在抵抗番茄花叶病毒中的功能。主要结果如下：.利用cDNA末端快速扩增技术得到了包括非翻译区在内的DCL2b基因全长，为其功能的研究奠定了基础。在野生型番茄的叶、花及不同发育时期的果实中，利用实时定量PCR技术对 DCL2b进行表达含量分析。结果表明，DCL2b在不同组织与果实不同时期的表达差异较大，在绿熟期果实中含量最高。.对DCL2b进行组织定位实验，结果显示，DCL2b在番茄不同组织中均有高表达。亚细胞定位结果显示DCL2b主要在细胞质表达，但活性不高。.利用CRISPR/Cas9技术得到番茄dcl2b突变体，通过small RNA-seq进行病毒检测以及病毒接种实验验证可知，dcl2b受到番茄花叶病毒侵染后，出现明显的病毒症状。对染病及未染病的dcl2b进行small RNA-seq分析后发现，染病后，很多22nt的micro RNA（miRNA）含量降低，这些miRNA可以作为次级小干扰RNA（sec-siRNA）生成的触发器，它们含量的降低使得许多抗病毒相关基因的sec-siRNA生成明显下降。对野生型植株和dcl2b突变体进行转录组测序分析，结果显示在染病后，dcl2b中脂肪酸代谢相关基因表达降低，鉴于病毒的复制需要宿主脂质的参与，这些基因含量的降低可能是植物想要降低病毒在体内的复制水平。.在染病和未染病的dcl2b中，22nt的miR6026均明显降低。其前体结构与大部分miRNA前体相比，更接近于双链RNA而非“茎环结构”的单链RNA。为检测miR6026是否为DCL2b的剪切产物，在烟草中超表达DCL2b蛋白并利用两步法对其进行纯化，体外转录得到miR6026前体后，进行体外剪切实验，阳性对照得到了目的产物但DCL2b并未对miR6026前体进行剪切，猜测DCL2b需要互作蛋白来行使剪切功能。