上调IRX1基因表达抑制胃癌侵袭转移的新功能发现与鉴定

IRX1基因是本课题组提出的胃癌候选抑癌基因。前期研究构建了pEGFP-IRX1真核表达载体，成功筛选到稳定转染的SGC-7901胃癌细胞株。上调IRX1基因表达可降低胃癌细胞株增殖活力及软琼脂集落形成能力，但对凋亡影响不明显，与传统抑癌基因过表达后的效应不完全一致。而划痕实验、迁移和侵袭实验中我们惊奇的发现，上调IRX1基因表达具有明显抑制胃癌细胞划痕愈合及侵袭迁移作用！迄今已发现的胃癌转移抑制基因尚不多，本项目将以这一新发现为主线，通过对裸鼠体内的胃癌转移能力分析、癌细胞与细胞外基质结合力分析、细胞周期与增殖凋亡分析、IRX1基因转染对经典转移相关基因uPAR、MMPs等以及对血管生成的影响，并结合基因表达谱芯片分析，探明IRX1基因的转移抑制作用及可能机制，识别并鉴定受转录因子IRX1调控的下游靶基因与信号通路。为开发预测胃癌预后新标记以及基因治疗新靶点提供有价值的参考。

目的：观察过表达IRX1基因对胃癌腹腔扩散与肺转移的影响；过表达IRX1对周围血管形成和肿瘤自身血管拟态的影响，寻找IRX1影响肿瘤血管形成的相关调控基因；研究过表达IRX1对肿瘤细胞休眠的影响。方法：将IRX1转染胃癌细胞，收集培养上清液与血管内皮细胞（HUVECs）共培养，观察IRX1基因对体外血管形成能力的影响。观察转染IRX1基因的培养上清对鸡胚在体新生血管的影响。将转染IRX1的胃癌细胞置Matrigel胶三维培养体系连续培养7日，观察管状或网状结构，用过碘酸-希夫试剂（PAS）染色显示血管基底膜样物质，判断血管拟态形成。将转染IRX1基因的胃癌细胞接种裸鼠腹腔或尾静脉，观察对腹膜扩散和肺转移的影响。用染色质免疫沉淀（ChIP）法鉴定与血管形成相关靶基因，以过表达和基因干扰技术分析靶基因对胃癌血管形成与侵袭的影响。通过体外基质结合力、细胞周期与凋亡、转移相关基因uPAR等分析，研究IRX1基因转染对休眠的影响。结果：转染IRX1基因的肿瘤细胞在裸鼠腹膜的瘤结节与肺转移结节均少于对照组（P=0.001，P=0.012），CD34和PAS染色显示瘤组织微血管与拟态血管数目减少（P<0.001，P=0.002）；肿瘤细胞培养上清液可抑制血管内皮细胞的体外血管形成能力，形成的管腔、小管连接点数目及小管长度均低于对照组（P<0.001, P<0.001, P=0.022）；并对鸡胚新生血管形成有抑制作用（P<0.001）。在Matrigel胶三维培养中转染IRX1的肿瘤细胞其拟态血管连接点和管长度均低于对照组（P<0.001）。ChIP实验证实BDKRB2（缓激肽B2受体）是受IRX1调控的下游靶基因。过表达IRX1诱导胃癌细胞G0/G1期阻滞但凋亡变化不明显； ALDH、Sox2、Nestin、Oct4、Nanog、Stella和Gdf3干细胞相关基因表达上调；肿瘤对化疗药物5-FU、CDDP的半数抑制浓度（IC50）增加，但对盐霉素（Salinomycin）的IC50下降；IRX1基因转染使uPAR表达下降。结论：恢复IRX1基因表达抑制肿瘤的腹膜扩散和转移与其瘤体内新生血管及血管拟态减少有关；IRX1基因通过下调BDKRB2发挥了抑制血管形成作用；BDKRB2有望成为干预胃癌血管形成的靶点；IRX1基因参与了胃癌细胞的休眠调控。