新型磷酸二酯酶-4（PDE4）抑制剂罗氟普兰抗抑郁效应的机制研究

The data from our lab shows new phosphodiesterase-4(PDE4) specific inhibitor roflupram can improve depressive-like symptoms both in tailing suspension test and forced swimming test in mice with high enzyme inhibition efficacy. And also roflupram does not cause any nausea or emesis which is the severe side effects with classical PDE4 inhibitor. Considering the highly specific selectivity of PDE4, we speculate the possible mechanism of roflupram is due to the activation of cAMP/PKA/CREB signaling cascades through inhibiting the hydrolysis of intracellular cAMP. The current project is designed to investigate whether the antidepressant roflupram might involve microglial activation. .To elucidate the possible mechanism for microglial activation and cAMP/PKA signaling pathways contributes to roflupram as an antidepressant, chronic unpredictable mild stress induced depressive mice were used, then morphological analysis of microglia in prefrontal cortex and dentate gyrus was determined with staining. Additionally, primary microglia were isolated from mice brain and collected for further investigation. With the intervene of adenlyate cyclase inhibitor SQ-22536 or PKA inhibitor Rp-cAMPs, we try to examine the effects of roflupram on microglial activation is dependent on cAMP/PKA. The results provide direct evidence that microglial alterations in morphology and function underlie the elucidating the antidepressant mechanism of roflupram.

本实验室已证实新型磷酸二酯酶-4（PDE4）抑制剂罗氟普兰具有高效的酶抑制活性，在动物模型中有良好的抗抑郁效应，且不具有传统抑制剂致呕吐的不良反应。现有的数据支持罗氟普兰抑制PDE4酶水解cAMP，升高细胞内cAMP水平，激活cAMP/PKA/CREB信号通路，但是关于罗氟普兰是否影响或调节抑郁症的小胶质细胞活化这一环节仍不清楚。本项目拟采用慢性抑郁症动物模型，探讨抑郁状态下前额皮质和齿状回部位的小胶质细胞形态学、活化、凋亡等方面的变化，验证罗氟普兰的抗抑郁效应与小胶质细胞之间的关系。以原代培养的小胶质细胞为实验对象，分别用特异性的抑制剂阻断cAMP的生成、抑制PKA活性进一步证实罗氟普兰干预小胶质细胞活化与cAMP/PKA、β肾上腺素受体之间的相关性，探索罗氟普兰改善抑郁症状是否依赖于调节小胶质细胞的活化，阐明小胶质细胞在形态与功能上的改变在罗氟普兰抗抑郁效应中的分子调节机制。

磷酸二酯酶-4（phosphodiesterase-4，PDE4）是广泛分布于中枢部位的特异性作用于第二信使环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的水解酶，将cAMP水解为无活性的产物5’-AMP。PDE4抑制剂可以抑制酶的水解活性，升高细胞内cAMP的水平，此为PDE4抑制剂得以实现抗抑郁效应的分子基础。罗氟普兰（roflupram）为新型PDE4抑制剂，在作用方式及特征上与传统的抑制剂均有较大的区别。本项目的主要研究内容是探讨罗氟普兰抗抑郁效应中小胶质细胞形态、活化、自噬等方面的变化，以阐明小胶质细胞在结构与功能上的改变在抑制剂抗抑郁效应中的分子调节机制。重要结果包括三个方面：（1）基于抑郁症的动物模型证实了罗氟普兰改善抑郁样症状与其影响小胶质细胞的活化状态及相关信号通路中蛋白分子的改变有密切关系。以慢性不可预见性温和应激（CUMS）建立小鼠抑郁症模型，罗氟普兰在剂量为0.5mg/kg和1.0mg/kg时能够显著改善小鼠的抑郁样症状，减少前额皮质和海马部位的炎症因子释放和蛋白表达，减少小胶质细胞活化标志物的表达，上述效应与HMGB1/RAGE/NF-κB信号通路有关。此外，罗氟普兰并不改善抑郁症小鼠HPA轴的功能紊乱。（2）由本实验室自行设计合成的、与罗氟普兰相同作用模式的抑制剂FCPR16，通过改善突触功能和神经发生、介导小胶质细胞的表型从M1至M2型的转换，是其抗抑郁效应的分子基础（成果已发表于Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2019;90:62-75.）（3）进一步探讨罗氟普兰的作用机制，发现罗氟普兰抑制小胶质细胞的活化与释放炎症因子、阻碍炎性小体的生成与自噬息息相关。罗氟普兰可以通过升高自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达水平和降低底物p62表达水平而诱导自噬。罗氟普兰虽为PDE4抑制剂，但对于PDE4各亚型没有很好的选择性，分别采用4B和4D亚型的慢病毒证实了PDE4B基因敲减可以诱导自噬和减缓炎症反应（成果发表于ACS Chem Neurosci. 2017;8(11):2381-2392.）。本项目的科学意义在于揭示了罗氟普兰作为酶抑制剂如何改善小胶质细胞的过度激活状态、抑制炎症因子的释放，进而产生抗抑郁效应，有助于认识抑郁症疾病状态下小胶质细胞的生物学功能。