转酮酶立体选择性的进化机制及其催化手性酮合成的研究

Transketolase is a valuable enzymatic tool catalyzing C-C bond formation. The applicant has cloned a thermostable transketolase, which.has been used in the synthesis of chiral deoxyketoses. The primary study revealed that this novel transketolase has the similar substrate tolerance with other bacterial transketolases. It can be inhibited by L-type aldehyde acceptors leading to the absence of the product with 4S configuration, which limits its application in the synthesis of chiral ketones with various configuration. Therefore, it is significant to study the reaction mechanism of transketolase to explain its enantioselectivity and stereoselectivity, and furthermore, extend its application in chemoenzymatic synthesis. In this project, it is planned to illustrate the enantioselectivity and stereoselectivity of transketolase using computational simulation and docking, followed by rational design and directed evolution to obtain a transketolase tool box which contains 2-3 variants with improved activity towards L-type acceptor and changed stereoselectivity. Using this tool box, various chiral ketones with 4S configuration will be synthesized. The model reaction of one-step chemoenzymatic synthesis of chiral ketones will be achieved.

转酮酶是酶促催化合成碳碳键的一个重要工具酶。申请人已克隆到一个耐高温的转酮酶，并初步应用于模式手性酮衍生物的合成。前期研究基础表明，该转酮酶和其它来源于微生物的转酮酶一样，受L构型底物抑制，不能合成4S 构型产物。这成为制约转酮酶在合成多立体构型手性酮应用中的关键障碍。因此，对该转酮酶的底物选择性和立体选择性进行反应机理层面的研究，并拓宽其在合成多种立体构型手性酮化合物中的应用，具有重要意义。本项目拟通过计算机模拟分子对接技术，结合该转酮酶底物谱和立体选择性的研究，阐明底物构型对该转酮酶活性影响的机理，解释该酶立体选择性机制。在此基础上，通过理性设计和饱和突变库的构建和筛选，获得2-3个能接受L构型底物并合成多种立体构型手性酮的转酮酶突变体。并以此为生物催化剂，合成4S构型手性酮模式化合物，实现转酮酶催化合成多种立体构型手性酮的模式反应。

转酮酶可酶促催化二碳单位的转移和手性羟基的引入，具有良好的工业应用价值和前景。由于转酮酶具有严格的底物区域和立体选择性，不能催化α位脱氧底物和L构型底物，限制了其在手性羟基酮合成中的应用。为了拓宽转酮酶的底物范围，我们从嗜热菌株Geobacillus sp.克隆获得三个嗜热转酮酶基因，并在大肠杆菌中获得高效可溶表达。对这三个嗜热转酮酶进行酶学性质鉴定，结果显示这三个嗜热转酮酶都表现出很高的耐热性，最适温度为70oC，最适pH为7.5。其中TK456的活性最好，对D-甘油醛和乙醇醛的比活力分别为4.2 U/mg和4.0 U/mg。特别是TK456对L-甘油醛有一定的活性，比活力为0.62 U/mg。为后继的定向进化改造转酮酶的底物范围奠定了很好的基础。.对转酮酶TK456的三维结构进行了计算机模拟。和底物分子对接，阐明了Leu191、Leu382、Phe435和Asp470在活性口袋中的相互位置关系和与底物的相互作用关系。选定Leu191、Phe435和Asp470作为突变位点。构建了单点和双点饱和突变库，并建立了基于pH的高通量筛选方法。通过饱和突变库的筛选，获得46个阳性突变体。对这些阳性突变体进行了酶学性质鉴定，包括热稳定性、底物谱和立体选择性。最终获得具有对α位脱氧和L构型底物耐受性和活性的不同立体选择性的转酮酶突变体F435L/D470E、L191V/D470I和L191Q/D470。并使用这些突变体合成了(3S)-1,3-二羟基-2-戊酮、(3R)-1,3-二羟基-2-戊酮和L-核酮糖。同时，尝试将转酮酶和转氨酶偶联催化合成手性多羟基胺。.项目成果丰富了转酮酶酶库，克服转酮酶在手性碳碳键合成中的底物和立体选择性障碍，为手性酮中间体的酶法合成提供三种理想的转酮酶工具，为建立工业生物碳碳键合成的新技术平台打下基础。同时，项目成果从理论上丰富了转酮酶的底物选择性和立体选择性分子水平的机理研究成果，丰富了定向进化改造酶立体选择性的策略。