细菌生物膜在细菌性角膜炎发病机制中作用的研究

细菌性角膜炎是当前发病率和致盲率最高的感染性角膜病。部分细菌性角膜炎病情反复病程迁延，且药敏试验鉴定敏感的抗生素，临床应用疗效甚微，出现体内体外相分离的现象。基于临床思考及对国内外研究现状的了解，提出假说：慢性难治性细菌性角膜炎与细菌生物膜(bacterial biofilm，BBF）的形成有关。BBF指细菌吸附于生物或非生物表面后，分泌多糖蛋白复合物并将其自身包裹其中而形成的膜样物，其毒力、耐药性和抗免疫性较浮游态菌均大大增强。本课题就以临床分离的眼科常见菌作为研究对象，就BBF的存在性、生物学特性、对其的干预等方面分体外实验和体内实验两部分进行研究，从而为探讨细菌性角膜炎的发病机制，继而为临床诊治提供依据。

本课题组在规定时间内顺利完成了如下三方面的研究：眼科感染常见菌生物膜形成能力的研究；眼科表皮葡萄球菌BBF相关基因及毒力基因的研究及眼科表皮葡萄球菌的耐药情况及对BBF药物干预的研究。取得了如下结果：96株表皮葡萄球菌中，CRA实验的阳性率为34.38%，结晶紫微孔板实验的阳性率为28.13%，BBF相关基因icaA基因检测的阳性率为40.63%。27株金黄色葡萄球菌中，CRA实验的阳性率为55.56%，结晶紫微孔板实验的阳性率为51.90%，BBF相关基因icaA基因检测的阳性率为11.11%。29株铜绿假单胞菌中，CRA实验和结晶紫微孔板实验的阳性率均为0，BBF相关基因pslA基因检测的阳性率为31.03%。三个菌种之间CRA法和结晶紫微孔板法的检测的BBF形成能力相比较，其差异有统计学意义 (P＜0.05)。银染法和结晶紫法均能清晰地显示BBF形成的结构特点，SEM可以观察BBF的三维立体结构。浮游状态的BBF形成能力不同的菌株其BBF相关基因icaA,sarA的的mRNA表达结果为，BBF强阳性株＞BBF阳性株＞BBF阴性株；毒力基因atlE, zinC的的mRNA表达结果为，BBF阴性株＜BBF强阳性株＜BBF阳性株。随着BBF的形成，BBF相关基因icaA其mRNA的表达逐渐下降，其相对表达量在培养1d时最高，培养7d时最低，仅有微量表达（P＜0.05）；BBF相关基因sarA其mRNA相对表达量在培养1d时最低，培养3d的表达量与培养1d相比差异无统计学意义（P＞0.05），此后其表达呈升高趋势，培养7d时表达最高（P＜0.05）。随着BBF的形成，毒力基因atlE及zinC其mRNA的表达逐渐下降，其相对表达量在培养1d时最高，培养7d时最低（P＜0.05）。BBF阳性菌株的耐药率（除万古霉素外）高于BBF阴性菌株(P＜0.05)。万古霉素、夫西地酸、双氯芬酸钠对BBF表现为抑制作用(P＜0.05)；红霉素、阿奇霉素、庆大霉素对BBF表现为促进作用(P＜0.05)；妥布霉素的浓度在2～512mg/L范围时对BBF表现为促进作用，而在1024mg/L、2048mg/L的浓度时对BBF表现为抑制作用(P＜0.05)。利福平在2～128mg/L的浓度范围内对BBF有促进作用(P＜0.05)，在512～2048mg/L的浓度范围内对BBF有明显的抑制作用。