海洋细菌胞外多糖 EPS273 抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的分子机理研究

Pseudomonas aeruginosa is one of the most serious nosocomial and opportunistic pathogen, and its resistance to antibiotics is increasing as time goes on. Notably, the resistance to antibiotics is closely related to biofilm formation. Exopolysaccharide EPS273 we previously isolated from marine bacterium not only dramatically inhibits the formation of biofilm and the infection to human cell and zebrafish by Pseudomonas aeruginosa, but also has anti-biofouling activity in the marine environment, where the biofouling is in connection with biofilm formation. Therefore, it is very important to investigate the molecular mechanism of bacterial exopolysaccharide EPS273 inhibiting the biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa, not only in combating the clinical infection by Pseudomonas aeruginosa, but also in preventing the marine biofouling. Considering the biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa is regulated by a series of regulation factors, this study is planning to identify the biofilm-related genes in Pseudomonas aeruginosa influenced by bacterial exopolysaccharide EPS273 using transcriptome analysis and molecular genetics method, and analyze the corresponding regulation pathways by gene knock-out and complemental experiments, then reveal the molecular mechanism of bacterial exopolysaccharide EPS273 inhibiting the biofilm formation. The results of this study will deepen and expand the people’s knowledge about the mechanisms of action of antibiofilm agents, and provide the theory basis for further application of bacterial exopolysaccharide EPS273.

铜绿假单胞菌是目前最严重的院内获得性感染条件致病菌之一，其耐药性有逐年增加趋势，而生物膜形成与其耐药性密切相关。我们前期从海洋细菌中分离的细菌胞外多糖EPS273不仅能显著抑制铜绿假单胞菌生物膜形成，大大降低铜绿假单胞菌对人体细胞和斑马鱼的感染，还在海洋环境中具有防治生物污损的活性，而生物污损与生物膜形成密切相关。因此，对 EPS273抑制生物膜形成的分子机制研究在治疗临床上由铜绿假单胞菌引起的感染和防治海洋生物污损方面具有重要意义。因铜绿假单胞菌生物膜形成受一系列调控因子调控，本研究拟采用转录组学及分子遗传学等方法确定铜绿假单胞菌中受EPS273显著影响的与生物膜形成密切相关的基因，并结合相关基因的缺失与互补等实验解析相应调控途径，深入揭示EPS273抑制生物膜形成的分子机制。本研究的研究成果将加深并扩充人们对生物膜抑制剂作用机制的认识，并为EPS273的进一步开发利用提供理论。

本实验室前期从海洋细菌中分离的胞外多糖EPS273不仅能显著抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成，还可明显降低铜绿假单胞菌的侵染性。为进一步提高EPS273的产量，并为深入了解EPS273抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的分子机制奠定基础，我们首先对EPS273产生菌Pseudomonas stutzeri 273进行了全基因组测序，并借助生物信息学技术界定了EPS273多糖的生物合成基因簇；对该基因簇中的关键基因敲除发现该基因簇不仅与EPS273的生物合成密切相关，还影响EPS273产生菌的形态及生物膜的形成。在明晰EPS273生物合成的基础上，我们对铜绿假单胞菌经EPS273处理前后进行了转录组分析，结果表明铜绿假单胞菌经EPS273处理后与生物膜形成密切相关基因的表达水平发生了明显的改变。与生物膜形成密切相关的双组份调控系统PhoP-PhoQ及群体感应系统LasI/ LasR 和 RhlI/ RhlR的表达水平显著降低，与胞外多聚物及毒力因子形成相关的基因表达水平也发生了明显的改变，从而显著降低了胞外多聚物及毒力因子的产生。此外，与细菌鞭毛形成、细胞迁移及胞外铁离子获取能力相关基因的表达水平也发生了明显的降低，而这些基因均与生物膜的形成密切相关。为进一步验证转录组分析结果，我们还对其中表达水平发生明显变化的基因phoP、phoQ、eddA及eddB进行了相应的基因破坏与互补实验，结果证明phoP、phoQ及eddA经基因阻断后其生物膜的形成和细胞的迁移性能大大降低。综合我们转录组和基因阻断及回补的实验结果和以前的文献报道，我们推测EPS273首先通过影响双组份调控系统PhoP-PhoQ的表达，进而调控群体感应系统的LasI/ LasR和 RhlI/ RhlR的表达水平，而群体感应系统进一步调控与生物膜形成密切相关基因的表达。本研究不仅确定了EPS273的生物合成基因簇，为进一步提高其产量奠定了基础，还在转录组水平上阐述了其抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的分子机制，为其进一步开发利用奠定了基础。