祛邪胶囊影响晚期结直肠癌FOX家族调控T辅助免疫平衡的机制研究

The existing research shows that: the inhibition of Fox family, the Treg molecules on DC cells is an important way to immune imbalance in advanced colorectal cancer. 15 years of clinical and basic research shows, Quxie Capsule can prolong the survival time of advanced colorectal cancer, which has the advantages of high efficiency and low toxicity of cheap, discuss the possible mechanism, Quxie Capsule of the targets and advantage of the crowd is the key to solve the problem. The detecting Quxie Capsule on autophagy related gene silencing in colorectal cancer and liver cells LC3, Casepase-3, PARP, Bcl-2, Beclin-1 changes, in vitro experiments to investigate its effects on the growth, apoptosis and autophagy of tumor cells. Established the Foxp3 gene knockout mouse model of CT26 carcinoma in vivo observation, Quxie Capsule intervention after NK, Th17/Treg, Th1/Th2 expression and immunological changes and Foxo1, Foxo3 gene, to investigate the influence of Quxie Capsule on Treg upstream of the Fox gene family, the use of small sample in randomized double blind clinical study method, find Quxie capsule dry the prognosis of best and worst immune differences between cases, clinical immunology index and the mechanism to explore clinical advantages and disadvantages in patients with colorectal cancer, eventually find a immune indexes for the crowd of Chinese medicine effective treatment method for advanced.

现有研究表明：Fox家族诸分子、Treg对DC细胞抑制是晚期结直肠癌免疫失衡的重要途径。我科15年研究表明，祛邪胶囊延长晚期结直肠癌生存期，高效低毒价廉。探讨祛邪胶囊可能作用机制、靶点及优势人群是本研究拟解决的关键点。拟通过①检测祛邪胶囊对自噬相关基因沉默后的肠癌细胞LC3、Casepase-3、PARP，Bcl-2，Beclin-1 变化，体外实验观察其对肿瘤细胞生长、凋亡、自噬影响。②建立Foxp3基因敲除CT26肠癌小鼠模型, 体内实验观察祛邪胶囊干预后NK,Th17/Treg，Th1/Th2免疫指标变化及Foxo1、Foxo3等基因表达，探讨祛邪胶囊对Treg上游Fox家族基因影响,③以小样本随机对照双盲临床研究，寻找祛邪胶囊干预后最佳和最差病例间免疫差异点，探寻临床优势和劣势人群临床免疫学指标和作用机理，为晚期结直肠癌患者找到一种有免疫指标判定适合人群的中医治疗有效方法。

本研究从临床研究及基础研究两个方面对祛邪胶囊作用的疗效及机制进行了研究。临床研究发现：(1)常规治疗加祛邪胶囊治疗组与单纯常规治疗组比较，祛邪胶囊可延长晚期结直肠癌总生存约9个月。(2)通过对祛邪胶囊治疗最佳最差病例比较，发现祛邪胶囊作用的优势人群特征为：女性、年龄＜65岁、结肠、脾肾亏虚、瘀毒、RAS/BRAF突变型。而西医认为RAS/BRAF 野生类型预后更加，说明祛邪胶囊治疗的优势人群与西医医疗不同，可在一定程度上互补，使不同的患者达到最大的受益。免疫相关指标在中医干预后均有改变，在优势人群总体现不明显，故应进一步扩大样本量，以进一步总结免疫特征。(3)通过比较祛邪胶囊治疗前后免疫细胞及细胞因子的变化发现，无论在男性还是女性，祛邪胶囊治疗后炎症抑制相关细胞因子诸如IL-10, IL-4d等水平增高，说明祛邪胶囊可能通过免疫调节发挥作用。而这一假设在基础实验中得以验证。Fox家族诸分子Foxo1为免疫调节的重要基因之一，其可发挥调节T-bet, Foxp3的表达，进而分别调节Th1/Th2, Th17/Treg等T辅助免疫平衡；另一方面Foxo1可影响细胞周期，细胞凋亡等多个细胞的生理病理过程，被认为是肿瘤抑制基因。我们通过体内实验发现：(1)祛邪胶囊可抑制CT-26移植瘤小鼠肿瘤细胞的增长，通过流式细胞术发现与对照组相比祛邪胶囊促进了Th1/Th2向Th1漂移, Th17/Treg平衡向Th17漂移，促进了体内的肿瘤免疫反应。通过对影响Th1/Th2比值及Th17/Treg比值的上游蛋白T-bet, Foxp3分析发现，在祛邪胶囊组T-bet及Foxp3蛋白的表达增加。(2)祛邪胶囊促进了凋亡相关蛋白FasL, Bim, Cleavd Caspse-3, Bcl-2等分子的表达，说明在发挥抗肿瘤免疫的同时还可发挥细胞毒作用，而这些作用是通过对Foxo1的调节实现的。体外沉默Foxo1后，相应的蛋白表达水平降低，且祛邪胶囊的作用减弱 ，这也论证了上述结论。综上，祛邪胶囊可延长晚期结直肠癌生存期，其作用的优势人群的特征为：女性、年龄＜65岁、结肠、脾肾亏虚、瘀毒、RAS/BRAF突变型。祛邪胶囊可能作用机制是调节Foxo1基因表达，从而影响T辅助免疫平衡的调节以及细胞毒双向作用。