介导铜绿假单胞菌耐亚胺培南的新外排泵系统的筛选

细菌耐药性目前已成为全球性关注的问题，特别是铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药性是目前国内外研究的热点，目前研究认为铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药主要系①外膜蛋白oprD2缺失②产生金属酶③AmpC合并外膜屏障机制④青霉素结合蛋白改变所致。而外排泵机制并不起主要作用。但我们在研究中发现外排泵抑制剂能够逆转52%的铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药性。因此推测可能有外排泵机制参与了铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药性的形成，并起到主要作用。本研究旨在以往研究基础上，拟通过采用realtime-PCR和蛋白质组学技术筛选亚胺培南耐药菌株中高表达的外排泵系统，然后采用基因敲除技术沉默高表达的外排泵基因，观察外排泵高表达与亚胺培南耐药之间的关系，以期发现一种新的与亚胺培南耐药相关的外排泵，从而证实这一新的外排泵系统介导亚胺培南耐药的新机制。这对于研究铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药性的发生机制以及延缓耐药性产生均具有重要意义。

耐药性目前已成为全球性关注的问题，特别是铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药性是目前国内外研究的热点，目前研究认为铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药主要系①外膜蛋白oprD2缺失②产生金属酶③AmpC合并外膜屏障机制④青霉素结合蛋白改变所致。而外排泵机制并不起主要作用。但我们在研究中发现外排泵抑制剂能够逆转铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药性。因此推测可能有外排泵机制参与了铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药性的形成。本研究利用Carba-NP试验、EDTA协同试验和Etest分别测定了141株碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌的碳青霉烯酶，结果显示仅4株菌株为阳性结果，只占2.8%；因此得出结论产酶不是导致铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制；采用PCR和SDS－PAGE方法分析了141株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌的外膜孔蛋白Opr D2编码基因和opr D2蛋白，结果显141株耐药株Opr D2编码基因发生显著变异,变异位点呈现多样性。34株Opr D2编码 基因存在大片段缺失，6株显示Opr D2编码基因中有插入片段，96株有小片段缺失或不同 位置的多点突变，4株产金属酶菌株及1株亚胺培南敏感（美罗培南耐药）株Opr D2编码 基因未发现异常。提示这些菌株中Opr D2编码基因的缺失或突变是引起铜绿假单胞菌对 亚胺培南耐药的主要机制，Opr D2基因缺失突变是导致Opr D2 蛋白丢失的分子基础。利用外排泵表型筛选实验、Real-time PCR检测其mexA mRNA表达水平、PCR检测外排泵编码基因及调节基因mexR、nalC、nalD，结果显示外排泵机制可以造成铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药（不仅仅是导致美罗培南耐药），外排泵系统的过度表达主要是由于其相应的调节基因突变所致。此外利用同源重组技术，敲除了外排泵MexAB-OprM系统中MexA基因，明确了外排泵MexAB-OprM与亚胺培南耐药之间无必然联系，亚胺培南耐药可能系其他外派泵的高表达所致。从而证实了外排泵系统介导亚胺培南耐药的新机制。这对于研究铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药性的发生机制以及延缓耐药性产生均具有重要意义。