苹果酸对植物C4光合途径形成的调节功能及作用机制研究

C4植物玉米第1～3叶维管束鞘细胞(BSC)叶绿体有垛叠的基粒和PSⅡ活性，主要利用Rubisco固定CO2进行C3光合；而4叶以上，叶肉细胞大量合成苹果酸并向BSC叶绿体转运，脱羧产生CO2进行C3光合，同时后者的基粒和PSⅡ活性消失。因此，苹果酸与BSC叶绿体的基粒发育和PSⅡ活性消失有关。苹果酸是细胞多种代谢的联接者和调节者。可能在C4光合途径进化和形成过程中具有重要调节作用。然而，关于苹果酸的作用及机制尚未见报道。本项目拟利用基因工程技术获得转反义PEPC的玉米植株和转C4-PEPC的水稻（C3）植株，观察苹果酸含量变化对叶片C4关键酶基因表达和BSC叶绿体分化及相关基因表达的影响，并结合外源苹果酸效应，阐明苹果酸在C4循环形成和BSC叶绿体分化中的作用及机制，为阐明植物C4光合途径形成和BSC叶绿体分化机制提供新的思路和理论依据，也为利用转基因技术改造C3作物的光合作用提供参考。

C4植物玉米的第1～3叶维束鞘细胞叶绿体（BSC）有垛叠的基粒和PSⅡ活性，利用Rubisco固定CO2进行C3光合；而4叶以上，叶肉细胞大量合成苹果酸并向BSC叶绿体转运，同时后者的基粒和PSⅡ活性消失。因此，苹果酸与BSC叶绿体的基粒发育和PSⅡ活性消失有关。苹果酸是细胞内多种代谢的联接者和调节者。可能在C4光合途径进化和形成过程中具有重要的调节作用。本课题观察了不同碳同化途径玉米叶片的PEPC活性、苹果酸含量和解剖结构，检测了外源苹果酸对玉米和烟草叶圆片及对转C4-PEPC基因水稻活体叶片光合作用的效应，并完成了抑制玉米C4-PEPC基因表达的RNAi 载体构建。主要结果如下：.1．苹果酸代谢与BSC分化具有密切关系 随着玉米叶片的发育，C4循环关键酶活性也随之增加，BSC叶绿体的C4结构特征越来越明显，内源苹果酸代谢增强，外源苹果酸处理玉米离体叶圆片和根系饲喂水稻抑制叶片的光反应。.2．苹果酸在C4植物光合途径发育中的作用机制 （1）苹果酸的供应降低叶绿体中NADP的数量，增大NADPH/NADP的比值，阻碍电子传递的进行，促进活性氧的产生；（2）苹果酸的脱羧或脱氢反应改变细胞的氧化还原状态，进而影响PSⅡ的结构和功能；（3）苹果酸脱羧后生成的丙酮酸可能影响细胞的氧化还原状态和PSⅡ的结构。.3．苹果酸在转基因水稻中的作用机制 在转C4-PEPC基因的水稻中，PEPC基因的表达使苹果酸代谢增强，OAA不均匀进入不同的叶绿体。苹果酸在高还原能力的叶绿体内合成，在低还原能力的叶绿体内脱羧。在两种叶绿体之间可以进行C4微循环。.4．玉米C4-PEPC基因的克隆、载体构建和转入北方粳型超级稻 以国内玉米优良自交系郑58为材料，分两步克隆了C4型PEPC基因的启动子和其剩余全长序列，成功构建了pCAMBIA-1391Z-PEPC载体，利用农杆菌介导法将其转入悬浮培养的北方粳型超级稻沈农265的愈伤组织，获得了PEPC酶活性显著提高，苹果酸代谢增强的转基因植株。.5．C4-PEPC基因 RNAi载体的构建 选择一个C4-PEPC内含子序列作为RNAi干扰的间隔区域，先克隆正向片段与内含子，然后与反向片段连接，成功构建了RNAi植物表达载体p7002-Z-F，预期获得苹果酸代谢减弱的转基因玉米。