NETs在中性粒细胞抗疣状瓶霉感染中的作用

Phialophora verrucosa infection usually has prolonged course, stubbornly intractable skin lesions, affecting the quality of life of patients and even life-threatening. Neutrophil Extracellular Traps (NETs), as an extracellular killing mechanism of neutrophils, plays a key role in the antifungal immune response，so it means a great deal of the study on NETs in the role of P. verrucosa infection. Since we have demonstrated the inducement of NETs in the infection of P. verrucosa，we are plan to confirm the relevance of the quantity and the killing effect of NETs based on the Colony-Forming Units (CFU). And, we will confirm the importance of NETs in the neutrophil extracellular mechanism through suppression of NETs and Intracellular killing mechanism. Further, we will purify the granular extracts of neutrophils, and then confirm the effective fungicides, and clarify the role of NETs in P. verrucosa infection. Our study will provide the basis for the implement of immune treatment.

疣状瓶霉所致感染病程迁延、顽固难治，严重影响患者生活质量甚至威胁生命。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）作为中性粒细胞一种胞外杀伤机制，是宿主抗真菌免疫反应的关键效应机制，研究疣状瓶霉感染过程中NETs的作用具有重要意义。申请人已证实疣状瓶霉可刺激中性粒细胞产生NETs。本研究拟通过正常人中性粒细胞与疣状瓶霉的相互作用，明确NETs的量与其对疣状瓶霉杀伤效应的关系；通过抑制NETs的产生及细胞的胞内杀伤，明确NETs在胞外杀伤机制中的重要性；通过提取中性粒细胞颗粒蛋白及组蛋白，观察疣状瓶霉的菌落计数单位，明确NETs的主要作用成分，揭示疣状瓶霉感染中NETs的作用机制，为今后开展免疫治疗奠定基础。

疣状瓶霉、镰刀菌引起的感染病程慢性、迁延、皮损顽固难治、不断进展，少数可泛发播散，是一类严重影响患者生活质量甚至威胁生命的疾病，且抗真菌类药物种类有限，不良反应大，因此寻找安全有效的治疗真菌的方法迫在眉睫。本课题研究了中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在抗疣状瓶霉中的作用，同时研究了δ氨基酮戊酸介导的光动力学疗法 (ALA-PDT )对镰刀菌的杀伤效应及其作用机制；通过体外药敏试验及体内动物模型，探讨了阿莫罗芬及伏立康唑在抗镰刀菌中的相互作用。结果发现: （1）通过荧光共聚焦倒置显微镜(Confocal)观察到，疣状瓶霉刺激中性粒细胞可诱导NETs的生成，（2）NETs对疣状瓶霉孢子具有杀伤效应，且该效应与NETs的量呈正相关；（3）在中性粒细胞对疣状瓶霉菌丝杀伤效应中，胞外杀伤机制起主要作用。（4）NETs在中性粒细胞对疣状瓶霉的胞外杀伤机制中发挥着主要作用；（5）ALA-PDT对体外培养的镰刀菌有杀伤效应，且该效应与光敏剂有明显的剂量依赖关系；同时研究发现ALA-PDT可诱导镰刀菌孢子的凋亡，进而进入坏死阶段，最终杀死真菌细胞，即ALA-PDT主要通过诱导镰刀菌细胞坏死来发挥杀伤效应；（6）我们通过体外药敏实验，发现阿莫罗芬、伏立康唑在杀伤镰刀菌中具有协同作用；通过大蜡螟动物模型，发现阿莫罗芬与伏立康唑联合用药时，可明显提高大蜡螟的生存率，差异有统计学意义；同时，动物模型病理组织切片结果显示联合用药组中菌种成份明显少于单菌组及单用药组。综上所述，上述结果为机体抗真菌感染机制的研究奠定了基础，也为疣状瓶霉、镰刀菌感染性疾病的治疗提供了新的视角。