利用可视可控hypocretin神经元凋亡的疾病模型进行发作性睡病发病机制研究

Narcolepsy is a chronic neurological sleep disorder associated with genetic and environmental factors. Type 1 narcolepsy is caused by extensive loss of hypothalamic neurons that produce the neuropeptides hypocretin(also known as orexin). The pathologic process that destroys the orexin-producing neurons and how the loss of these neurons results in sleepiness are unknown. In this project we will construct a transgenic animal model of narcolepsy whose apoptosis of hypocretin neurons are easily labelled and controllable, study relations of the mutant genes (purine receptor subtypes P2RY11 and myelin oligodendrocytes glycoprotein MOG) found in the patients of narcolepsy with the apoptosis of the hypocretin neurons, research the effect of the apoptosis of the hypocretin neurons on the other types of central neurons, the content of neurotransmitter, and downstream molecular regulation via Sleep/wake behavioral test, analysis of differentially expressed genes, neurochemistry, and histochemistry approaches. The results will provide new strategyies for further understanding narcolepsy, establishing new clinical diagnosis and treatment methods, and drug screening for narcolepsy.

发作性睡病（Narcolepsy）是一种具有遗传易感性、受到环境因素影响或触发的疾病。1型发作性睡病是由位于下丘脑hypocretin（或orexin）神经元大量缺失引起。但hypocretin神经元如何凋亡，凋亡后如何引起发作性睡病这些问题尚属未知。本研究通过转基因手段将绿色荧光蛋白和自杀基因转入hypocretin神经元内，构建可活体观察和控制hypocretin神经元凋亡的嗜睡病疾病动物模型；利用该模型研究在发作性睡病患者中发现的突变基因嘌呤受体亚型P2RY11基因和髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白MOG基因对hypocretin神经元凋亡的调节作用；利用睡眠觉醒分析系统，差异表达基因分析，神经化学，组织学等手段研究hypocretin神经元凋亡对神经递质，其他中枢神经元以及下游分子的影响。研究结果有助于阐明发作性睡病的致病机制，建立新的临床诊断和治疗方法，为发作性睡病的药物筛选提供新思路。

尽管已经确定1型发作性睡病是由位于下丘脑hypocretin（或orexin）神经元大量缺失引起的，但是hypocretin神经元如何凋亡？1型发作性睡病患者体内发现的突变基因p2ry11的致病机制又是怎么样的？这些问题还尚属未知。本项目构建了能够特异性标记hypocretin神经元并能特异性杀灭hypocretin神经元的疾病动物模型，利用该模型，结合1型发作性睡病患者中发现的突变基因p2ry11特异性的敲低来研究p2ry11的致病机制。运用分子生物学和转基因技术构建了转基因斑马鱼Tg[hcrt:NTR:GFP]，甲硝唑处理后的幼鱼hypocretin神经元数量减少，白天睡眠增多，很好的体现1型发作性睡病的典型特征。啮齿类动物中缺乏p2ry11的同源基因限制了人们对P2ry11的功能探索，尤其是在发作性睡病中的机制研究。结合构建的Tg[hcrt:NTR:GFP]斑马鱼，我们敲低的p2ry11的表达后发现斑马鱼头部，体节和心脏的异常发育，呈现小头，小眼，体长变短，心包腔水肿肥大；Tg[hcrt:NTR:GFP]斑马鱼中敲低p2ry11后，hypocretin神经元的数量减少，hypcretin的表达下调，细胞凋亡增加，白天睡眠增加。这些结果表明p2ry11突变会导致hypocretin神经元的凋亡，增加白天的睡眠。本项目的研究结果表明p2ry11对hypocretin神经元存活具有调节作用，相关研究结果能够拓宽和丰富人们对1性发作性睡病产生的理解。