尖孢镰刀菌小RNA生物发生及其寄生发育致病作用机制研究

Fusarium oxysporum species complex is a kind of pathogenic fungi with a very broad host range. The small RNAs are a class of small noncoding RNAs that have emerged as one of the most important regulators for gene expression in diverse aspects of biology, as well as in parasitic development and pathogenicity of pathogens. In our previous work, the single-knockout mutants of the core genes (DCL、AGO and RdRP) for small RNAs biogenesis of Fusarium oxysporum f.sp conglutinans were constructed, and their morphology and pathogenicity were studied preliminarily. Based on the above results, the following researches will be conducted. Firstly, we will construct double or multiple knockout mutants, and then their morphology and pathogenicity will be studied in detail for illuminating the roles of DCL、AGO and RdRP gene in growth, development and pathogenicity of Fusarium oxysporum. Meanwhile, Solexa high-throughput sequencing of small RNA libraries of wild-type strain and knockout mutants will be performed in order to identify small RNAs and the functions of DCL、AGO and RdRP gene in small RNAs biogenesis of Fusarium oxysporum. Moreover, the key small RNAs related to pathogenicity of Fusarium oxysporum will be screened, of which target genes in Fusarium oxysporum and its host will be predicted and identified for illuminating the functions of small RNAs in regulating pathogenicity of Fusarium oxysporum and in cross-boundary regulation of host genes.

尖孢镰刀菌复合种是一种寄主范围极其广泛的病原真菌。小RNA是广泛存在于生物体中的一类起调控基因表达作用的非编码小分子RNA,对病原物的寄生致病具有重要的调控作用。本项目拟在前期获得甘蓝专化型尖孢镰刀菌小RNA发生途径关键基因DCL、AGO和RdRP单敲除突变体，并进行了初步的形态与寄生致病性研究的基础上，进一步进行基因的双敲除或多敲除，再对敲除突变体进行详细的形态及寄生致病性比较分析，阐明DCL、AGO和RdRP基因对生长发育及致病力的影响；同时采用Selexa高通量测序技术对尖孢镰刀菌野生型及敲除突变体小RNA进行测序，鉴定尖孢镰刀菌小RNA及DCL、AGO和RdRP在小RNA产生中的作用；并进一步筛选出尖孢镰刀菌寄生发育致病关键小RNA，预测其对自身及寄主可能的靶基因，并加以验证，解析小RNA对尖孢镰刀菌寄生发育和致病作用机制。

Dcl、Ago 及 Rdrp 基因是小 RNA 作用途径中的关键基因。DCL 蛋白负责双链 RNA 的切割产生小 RNA、 AGO 蛋白负责小 RNA 的功能行使、RdRP 蛋白负责小 RNA 信号的放大。本研究以尖孢镰刀菌粘团专化型Fox-A8 菌株为材料，以本实验室的 Fox-A8 基因组测序数据为基础，预测其 Dcl 基因、Ago 基因和 Rdrp 基因，经 RT-PCR 验证预测结果后用pKOV21 载体构建同源重组敲除载体，对这些关键基因进行敲除，然后分析突变体的表型及小 RNA 的变化，以此来探讨 Dcl、Ago 及 Rdrp 的基因功能，为尖孢镰刀菌小 RNA 功能的进一步研究奠定基础。.具体研究结果如下：.1. 尖孢镰刀菌粘团专化型 Fox-A8 菌株有 2 个 Dcl 基因、2 个 Ago 基因和 3 个 Rdrp 基因。.2. 尖孢镰刀菌 Dcl 基因影响菌丝的分支及分生孢子的产生；Ago 基因影响菌落的生长速度、边缘菌丝长度和单菌落孢子数量；Rdrp 基因影响菌丝的生长方式、菌落生长速度和分生孢子数量及形态。.3. Dcl 基因和 Ago 基因的敲除并不直接影响尖孢镰刀菌的致病力，Rdrp基因的敲除使尖孢镰刀菌致病力降低。.4. Dcl2 的敲除使产生的小 RNA 不再具有 5’末端尿嘧啶偏好性，Dcl1 和Dcl2 双基因敲除不仅产生的小 RNA 不具有 5’末端尿嘧啶偏好性，而且还严重影响了小 RNA 的长度分布，而 Dcl1 敲除突变体产生的小RNA 特性和野生型相似；Ago 基因和 Rdrp 基因的敲除对小 RNA 的产生和特性无显著影响。.5. Dcl1 和 Dcl2 双基因敲除突变体没有产生 miRDeep2 Score > 10 的milRNA，其余突变体均能正常产生 milRNA；Fox-milR-1 是所有候选 milRNA 中 reads 数最多，且除 Dcl 双敲除突变体不产生外，其余敲除突变体均能产生 Fox-milR-1，Fox-milR-1 可能在尖孢镰刀菌生长发育中发挥重要调节作用。