基于光敏剂ALA光漂白荧光信息的光动力疗法隐式剂量法研究

以第二代光敏剂ALA和白血病细胞HL60为研究对象，重点研究光敏剂的光漂白特性及其对活性氧产生及目标细胞灭活的表征；以光敏剂的光漂白特性为基础，以荧光监测方法为手段，建立新的光动力亚细胞层次目标靶位评价体系。通过构建光学多通道荧光分析系统，研究光动力疗法中ALA的光漂白特性与产生的荧光的关系，从而建立基于荧光光谱技术的ALA光漂白特性的荧光隐式剂量法，即通过测量PDT（光动力疗法）过程中的荧光光谱准确快速评估PDT作用过程中所产生的单态氧含量，从而确定PDT对靶细胞组织的光动力作用剂量。根据ALA的光漂白亚细胞分布特性，应用荧光探针技术，通过细胞器-细胞荧光强度比值法，确定基于ALA的PDT作用靶点，研究光动力作用的分子机理。项目的完成可提供一种可靠、准确的荧光光谱分析方法，成为研究光敏剂光漂白特性及研究光动力疗法机理的有效方式，对光动力治疗白血病的理论研究及可能的临床应用具有好的参考意义

根据项目申请书所界定的任务完成情况如下：.（1）实验系统搭建：根据项目各体系荧光采集的需要，构建光学多通道荧光分析（OMA）系统；为确保PDT作用顺利进行且数据稳定可靠，设计一项国家发明专利“一种实现LED面光源面积及光强可变的方法”及一项实用新型专利“一种光强可变的光动力反应装置”；.（2）光动力疗法中光敏剂光漂白特性研究：利用光学多通道（OMA）荧光分析系统，采集光敏剂溶液的光谱，由采集到的光谱利用曲线拟合技术构建背景荧光、光敏剂荧光和光产物荧光三种基本光谱，并分析三种荧光同溶液体系中光敏剂含量之间的关系；对在光动力反应过程中溶液内光敏剂的含量进行检测，以反映其光漂白的情况；结合化学反应动力学原理以及实验结果对光漂白规律进行深入研究；.（3）单态氧含量检测：应用光照射以激发光敏剂产生光动力效应，并加入ROS探针检测单线态氧的生成；分别在光照前后采集三种细胞器及DCF的荧光图像并进行荧光强度的定性分析；研究光敏剂ALA的光漂白特性与单态氧产量之间及与PDT作用效果之间关系的定量分析，建立基于荧光光谱技术的ALA光漂白特性的荧光隐式剂量法；.（4）光敏剂亚细胞分布位点光漂白作用实验研究：利用荧光探针技术，对细胞内ALA进行亚细胞定位和定量分析，确定ALA-PDT的作用靶点：以每种细胞器光照前的平均荧光强度为基准，光照60min后，线粒体区域荧光强度下降较大，即光漂白速率加快，其荧光强度的变化基本表征了HL60细胞活性的变化，辅以PDT作用前后HL60细胞内Ca2+浓度检测，推断线粒体是光动力作用的主要靶点之一；.（5）PDT作用前后HL60细胞超微结构形态观测：利用原子力显微镜，透射电镜、激光共焦显微镜对PDT作用各阶段的细胞进行高分辨成像，分析各阶段细胞的形态结构的超微变化，从而进一步探讨光敏剂诱导细胞死亡的方式及其作用靶点；.（6）现有光敏剂性能改善以及新型光敏剂材料的探索研究：以ALA为代表的传统光敏剂存在发射光谱弱、特异性靶向作用不强、易于光漂白等不足，因此，现有光敏剂性能的改善与提高、性能更好的光敏剂的研制是当前国内外研究的重点和热点问题，基于飞速发展的纳米技术及纳米材料本身特殊的物理和化学性能，我们探讨了CdS-TiO2、Fe-TiO2等纳米材料作为光敏剂对HL60细胞的灭活作用，以及将现有光敏剂纳米TiO2复合对光敏剂光敏性能的改善作用。