小鼠锌指蛋白CTCF对印记表达的mir-341、mir-1188的调控机制的研究

miRNA的表达调控机制的研究是当前miRNA研究领域的前沿热点问题。mir-341和mir-1188是两个相邻的母本表达的印记miRNA。CTCF是一种高度保守的多功能锌指蛋白，在印记基因的调控中具有重要的作用。通过生物信息学分析，我们在小鼠mir-341和mir-1188附近共发现四个高度保守的CTCF结合位点，其中第三个位点位于一个我们前期鉴定的差异甲基化区内，可能具有绝缘子的功能；而人的ENCODE计划已通过实验手段验证CTCF能结合于人基因组中的这四个位点。另外，已有研究证明mir-341、mir-1188及其附近区域与iPS细胞重编程的程度、腺相关病毒载体的基因组定点整合及其诱导的肝癌发生过程等存在密切的关联。为此，本项目利用ChIP，RNAi、miRNA定量PCR及染色体构象捕捉（3C）等技术研究CTCF对印记表达的mir-341、mir-1188的调控作用和机制。

小鼠Dlk1-Dio3印记区域内有三个父本甲基化的差异甲基化区（IG-DMR、Gtl2-DMR和Dlk1-DMR）。miR-341和miR-1188位于这一印记区域内Meg8的第二内含子中， CpG岛的预测表明其附近存在两个CpG岛（命名为CGI-1和CGI-2）。.首先，本研究分析了CGI-1和CGI-2的DNA甲基化模式及其在小鼠胚胎发育过程中的动态变化。结果表明CGI-2在E15.5和E18.5天的各组织中是一个母本甲基化的差异甲基化区；CGI-2在精子、卵细胞中都发生了高甲基化，在着床前的胚胎发育过程中逐渐去甲基化；着床后CGI-2发生了差异性的重新甲基化，它的母本等位快速地重新甲基化并一直维持高甲基化状态，而其父本等位在部分地重新甲基化后再次发生去甲基化；CGI-2在E7.5天之前建立起差异甲基化模式。CGI-1虽然在囊胚中也发生了去甲基化，但在小鼠精子、卵细胞、桑葚胚和着床后的胚胎中父母本都发生了高甲基化，并不具有等位差异性。.其次，本研究分析了差异甲基化区CGI-2及其上下游区域的组蛋白修饰的分布和CTCF的结合情况。ChIP实验的结果表明，组蛋白修饰H3K9me3广泛存在于CGI-2及其上下游区域；在肝脏中组蛋白修饰H3K4me3和H3K9me3同时存在于CGI-2，但在胎盘中CGI-2上只存在H3K9me3，缺乏激活性的H3K4me3。并且在小鼠肝脏和胎盘中CTCF只结合于差异甲基化区CGI-2。.再次，本研究构建了绝缘子分析用的系列载体，软琼脂集落形成实验的结果表明CGI-2具有绝缘子的活性，且其活性依赖于CTCF结合位点。.最后，本研究分析了miR-1188在肝脏中的表达谱，并鉴定Smad3为miR-1188的一个靶基因；构建miR-1188慢病毒载体，尾静脉注射妊娠期母鼠，观察过表达miR-1188对妊娠期母鼠及子代的研究影响。.综上所述， CGI-2是小鼠Dlk1-Dio3区域内的第一个母本甲基化的差异甲基化区。 CGI-2在着床前后的胚胎发育中经历了复杂的去甲基化和重新甲基化的动态变化过程，并在E7.5天之前建立起差异甲基化模式。H3K4me3和H3K9me3在肝脏中同时存在于CGI-2。CGI-2结合CTCF并具有依赖于其F结合位点的绝缘子活性。并发现Smad3 是miR-1188的一个靶基因，二者相互作用在小鼠胚胎发育中发挥一定功能。