柱花草MSRA基因的抗炭疽病功能分析

Stylosanthes is promising tropical legume forage, which is planted by one third tropical area in terms of variety. How to breed the Stylosanthes variety resistant to anthracnose has been an emergency problem to be solved in production field. It is difficult for Stylosanthes hybridization due to its self-pollination. Transgenic technology is an important effective method to breed Stylosanthes varieties resistant to anthracnose. The key to such a method is to clone the gene(s) with resistance to anthracnose. We used AFLP molecular marker technology and RACE technology to clone MSRA gene from Mineirao Stylosanthes with resistance anthracnose, and planed to analyze its function resistance to anthracnose. This project is planed to apply the quantity of hyp-metabolizing production and plant transgenic technologies to analyze the change of isoflavonviols content, the disease resistance material in Mineirao Stylosanthes, and its connection with MSRA gene, to analyze the infection of tobacco transformed by MSRA gene and infected CIAT2312 Stylosanthes to the content of isoflavonviols in transgenic plant. The research result is of theoretic importance to discover the molecular mechanism of Stylosanthes resistant to anthracnose, having important practical value for the selection of Stylosanthes variety resistant to anthrocnose and transgenic breeding of Stylosanthes with disease resistance.

柱花草是一类优良的热带豆科牧草，占世界热带地区栽培牧草品种的三分之一。如何获得抗炭疽病柱花草品种已成为生产上急待解决的问题。柱花草行自花授粉，杂交育种困难。转基因技术是培育抗炭疽病植株的一种重要的有效途经。柱花草转基因抗炭疽病育种的关键是需要克隆抗炭疽病基因。我们已利用AFLP分子标记技术和RACE技术从抗病的Mineirao柱花草中克隆了MSRA基因，并拟进一步分析其炭疽病抗病功能。本项目拟采用次生代谢产物定量技术和植物转基因技术，分析Mineirao柱花草中抗病物质- - 2′-羟基异黄酮含量的变化及其与MSRA基因表达的关系、MSRA基因分别转化烟草和感病的CIAT2312柱花草及其对转基因植株中2′-羟基异黄酮含量的影响。研究结果对于揭示柱花草抗炭疽病的分子机制具有重要的理论意义，同时，对于抗炭疽病柱花草种质筛选和柱花草转基因抗病育种具有重要的应用价值。

柱花草是一类优良的热带豆科牧草，占世界热带地区栽培牧草品种的三分之一，炭疽病是柱花草的主要病害。如何获得抗炭疽病柱花草品种已成为生产上急待解决的问题。柱花草行自花授粉，杂交育种困难。转基因技术是培育抗炭疽病植株的一种重要的有效途经。柱花草转基因抗炭疽病育种的关键是需要克隆抗炭疽病基因。我们已利用AFLP分子标记技术和RACE技术从抗病的Mineirao柱花草中克隆了MSRA基因，并期待进一步分析其炭疽病抗病功能。研究内容包括Mineirao柱花草叶片中与MSRA基因相关的异黄酮类等物质的提取、含量比较以及其次级代谢产物的分离鉴定及其抑菌活性检测、MSRA基因植物表达载体构建及转基因研究等。.项目建立了柱花草叶片异黄酮类物质的提取方法，Mineirao柱花草叶片中的异黄酮类物质总含量为感病柱花草的3倍；通过抗病与感病柱花草的高效液相色谱（HLPC）比较分析，有5种异黄酮类物质存在显著差异。建立了柱花草叶片次级代谢产物的提取分离方法，获得24个化合物并鉴定了其结构，发现2种新化合物；经对柱花草胶孢炭疽原菌的抑制活性检测，有9个单体化合物有活性，其中黄酮类化合物有2个，降倍半萜类化合物有2个，生物碱、三萜、苯丙素类、脂肪酸酯类和简单酚性化合物各一个。按活性总比值从高到低依次排列是：水杨酸(42.5)、大豆甾醇B (11.4)、美迪紫檀素(10.8)、Styleguol (4.7)、亚油酸甘油酯(3.5)、吲唑(2.2)、corchoionol C (1.5)、咖啡酸甲酯(1.3)、Stylegu A (0.8)；通过对转MSRA基因的柱花草组培苗接种炭疽菌试验，非转基因植株在接种炭疽菌第4天就开始有病斑出现，第7天就开始落叶，而转基因植株生长良好。.研究结果首次证明了柱花草抗炭疽病是由多个因子控制的，对揭示柱花草抗炭疽病机理具有重要意义。同时，还可应用柱花草叶片中水杨酸、soyasapogenol B 和美迪紫檀素的含量测定，筛选抗炭疽病柱花草亲本材料和鉴定抗炭疽病柱花草品种。