穿心莲内酯对白念珠菌耐药生物被膜的抑制作用及机制研究

白念珠菌对传统抗真菌药物的耐药现象不断增加，其主要原因之一在于白念珠菌容易形成生物被膜。被膜内的菌细胞能够逃逸抗生素的杀伤作用和机体免疫系统的清除,并成为潜在感染源,从而造成感染反复发作。因此寻找新型有效的抗真菌药物具有重要意义。我们前期研究发现，中药有效成分穿心莲内酯(AG)对白念珠菌生物被膜有显著抑制作用。在此基础上，我们试图：1）通过半定量RT-PCR检测白念珠菌黏附基因与菌丝形成相关基因的表达，观察AG对生物被膜形成初始阶段的影响； 2）采用HPLC法检测群感效应（QS）分子的释放及实时荧光定量PCR检测QS相关基因的表达，了解AG 对生物被膜形成调控机制的影响；3）运用流式细胞术及透射电镜检测AG对生物被膜细胞凋亡的影响；4）构建动物体内白念珠菌生物被膜，以比较AG对体内外生物被膜的作用。以期初步阐明AG抑制白念珠菌生物被膜的机制，为其防治白念珠菌生物被膜相关性感染提供实验依据。

本项目已完成。.重要结果：.（1）穿心莲内酯（AG）对白念珠菌氟康唑耐药株2h的早期黏附的干预作用较明显；qRT-PCR结果表明AG可显著抑制ALS3，EAP1的表达，但对ALS1的表达具有促进作用。结论：AG可能通过抑制白念珠菌氟康唑耐药株某些黏附基因的表达而抑制其早期黏附，而黏附是形成生物被膜的第一步也是非常关键的一步。.（2）AG能影响白假丝酵母菌菌落的形态，倒置显微镜观察表明AG能够抑制白假丝酵母菌菌丝及芽管的形成，qRT-PCR检测显示AG能使SUN41和CSH1基因表达下调和使CaPDE2上调。表明穿心莲内酯可能通过影响SUN41、CSH1与CaPDE2基因的表达而抑制白假丝酵母菌菌丝的形成，而菌丝是构成白念生物被膜的主要结构组分。.（3）AG能不同程度的影响白念珠菌生物膜分散细胞的活性；扫描电镜显示AG诱导生物膜分散的细胞均为酵母相；qRT-PCR结果表明AG使HSP90表达上调，使UME6和PES1表达下调。表明AG能一定程度的诱导白念珠菌生物膜分散，而分散是生物被膜引起感染播散的关键因素。.（4）1000，100µM的穿心莲内酯能诱导白念珠菌生物膜细胞核固缩、浓染致密，1000，100，10µM的穿心莲内酯能降低白念珠菌生物膜线粒体膜电位，提高细胞内ROS水平。表明一定浓度的穿心莲内酯可诱导白念珠菌生物膜分散细胞凋亡，而凋亡也是目前发现抗真菌的主要机制之一。.（5）白念珠菌生长2h时法尼醇和酪醇分泌量较少，AG作用后变化不明显；12h后分泌量最高，24h回落。不同浓度AG干预后，法尼醇含量降低，酪醇升高，呈现剂量依赖性。qRT-PCR结果显示， AG在2、12、24h时分别使CHK1与PBS2下调；HOG1变化不明显。.（6）穿心莲内酯衍生物炎琥宁（YHN）干预后的导管片上CFU明显少于空白组；XTT代谢活性也显示YHN组低于空白组，且呈剂量依赖性；扫描电镜照片显示YHN能显著减少白念珠菌对大鼠体内导管的黏附；qRT-PCR结果显示，YHN可下调ALS1、ALS3、HWP1、EAP1和MP65的表达量。表明YHN能抑制大鼠体内白念珠菌生物膜。.（7）AG联合氟康唑（FLC）抗耐药白念珠菌呈相加作用；AG对CDR外排功能无影响；AG可抑制MDR外排功能；AG联合FLC能显著提高耐药白念珠菌细胞ROS水平；AG与FLC联合作用于耐药白念