重复移植非造血干细胞对梗死心肌修复机制的研究

心肌梗死（MI）后心力衰竭（HF）是严重威胁人类健康的主要疾病，目前的常规治疗效果不满意。而单次非造血干细胞(NHSCs)移植在治疗MI-HF过程中，存在细胞存活少，疗效受限等问题。我们在15例临床研究中，采用重复NHSCs移植，可改善MI-HF患者的心功能；同时开展了猪NHSCs分离培养技术；建立了MI-HF猪模型并进行了重复NHSCs移植的初步探索。在此基础上本课题拟应用小型猪的极小胚胎样干细胞（VSEL-SCs）、骨髓基质干细胞（MSCs）经冠状动脉重复移植治疗MI－HF，示踪细胞存活、分化及细胞因子变化情况，阐明NHSCs重复移植对心功能和心肌灌注的影响；比较VSEL-SCs、MSCs移植的疗效；探索首次移植后产生的细胞因子调控再次移植NHSCs的归巢、分化，以及重复移植对梗死心肌的修复和改善疾病的预后作用，丰富干细胞研究内容，为重复移植策略提供新思路和依据。

目的：旨在比较免疫荧光染色激活细胞分选（FACS）方法、免疫磁珠细胞分选(MACS)法、Ficoll密度梯度离心法分离猪VSEL-SCs的效果，并进行体外鉴定、培养扩增，为进一步研究VSEL-SCs移植治疗MI-HF建立基础。.试验动物和方法：小型猪10头。1)干细胞分离 a) FACS分选法分离VSEL-SCs，局麻下从猪髂后上棘提取骨髓，经红细胞裂解液冲洗去除红细胞碎片，经FACS分选 VSEL-SCs，用流式细胞仪检测VSEL-SCs的表面标记物。b) MACS分选猪VSEL-SCs：经红细胞裂解液冲洗，离心收集，加入一抗和二抗包被的超微磁珠，将分离柱安装入磁场中分离。C) Ficoll密度梯度离心法分离MSCs，局麻下从猪髂后上棘提取骨髓，通过梯度离心的方法先对骨髓进行分离，去除大部分红细胞、脂肪细胞和血小板，获得纯度较高的单个核细胞。提取单个核细胞层细胞培养24h待大量细胞贴壁后，经过多次换液与传代去除培养瓶内悬浮未贴壁的造血细胞，MSCs逐渐得到进一步纯化。2) 干细胞培养、鉴定：a) 分选后收集细胞，予固化、包埋进行透视电镜观察细胞显微结构。b )分选后加入条件培养基培养，一定时间后采用荧光标记抗体标记，进行间接免疫荧光染色和碱性磷酸酶染色鉴定，倒置相差显微镜观察细胞形态，精确计数。.结果：FACS和MACS分选法均能从猪骨髓中分选出VSEL-SCs，但数量极少，占骨髓中总单核细胞的0.01～0.03%。通过免疫荧光染色证实其表达胚胎样标志Nanog，SSEA-1，Oct-4，Sox-2；非造血干细胞标志Lin−CD45−；和其它干细胞标志： CXCR4+，碱性磷酸酶染色阳性。透视电镜显示VSEL-SCs十分细小，5～7微米，细胞超微结构表现为细胞核大、细胞质少。. 结论：1)与经典FACS分选法相比，MACS分选VSEL-SCs细胞得率高，耗时短。2) VSEL-SCs分离只能用红细胞裂解法，而Ficoll密度梯度离心法分离VSEL-SCs 会丢失大量目标细胞。3) 在通常培养条件下，猪VSEL-SCs离体扩增较困难。