超高灵敏流式分析技术及其在致病菌快速鉴别中的应用

本项目拟通过多通道超高灵敏流式检测仪的研制及其与生物探针的有机结合，建立灵敏、快速、特异的致病菌鉴别诊断新技术，不仅有望将细菌的检测灵敏度较现有的分析方法提高1～2个数量级，而且可同时实现总菌和致病菌的准确计数及活菌与死菌的明确区分。研究工作将在实验室自行研制的双通道单分子流式检测仪的基础上开展，通过仪器改进，增加一个荧光检测通道；利用核酸染料的通用性和致病菌单克隆抗体的特异识别性，在多通道超高灵敏流式检测仪上快速地获取样品中的总菌及致病菌浓度等多参数信息。创新性地提出建立双砷染料－四半胱氨酸重组噬菌体体系，对细菌进行特异性识别及信号放大，不仅可突破抗体难以获取的瓶颈，而且能扩大细菌的检测种类，有效鉴定细菌的存活状态。本项目综合运用仪器、荧光探针、分子生物学等领域的最新研究成果，发展致病菌的快速鉴别诊断技术，在食品安全、环境监测、疾病诊断治疗和生物恐怖袭击的防范等领域具有广阔的应用前景。

我们将实验室自行研制的超高灵敏流式检测装置（HSFCM）改进为双荧光检测，采用抗体、核酸共染法，通过HSFCM对致病菌和总菌进行同时计数，发展了高灵敏、高特异性的细菌绝对定量分析方法，与传统的平板计数法具有很好的一致性。将抗体与核酸共染的双荧光法应用于天然矿泉水中致病菌的检测，结合离心富集法可使检测限降低到100 细菌/mL，该研究论文被（Anal. Chem. 2010, 82, 1109）被美国分析化学官网highlight。. 为了突破细菌的特异性抗体难以获取的瓶颈，我们利用噬菌体的寄生专一性及其在宿主菌中快速扩增的特性，结合双砷染料对四半胱氨酸序列的高灵敏、高选择性荧光标记，构建了集宿主识别、信号放大、传感为一体的多功能探针，利用四半胱氨酸标签重组噬菌体，发展了灵敏、特异的细菌鉴别新方法（Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 5873）。. 我们利用HSFCM的超高灵敏性对单个细菌的绿色自发荧光进行了检测和定量，通过连二亚硫酸钠强还原剂的荧光淬灭实验证明细菌的绿色自发荧光主要来源于细菌中氧化型的核黄素类物质。利用FITC当量已知的荧光纳米标准球对细菌的自发荧光进行标定，发现单个细菌自发荧光的亮度在80－1400个FITC当量范围。这是国际上首次对单个细菌的自发荧光进行FITC当量报道，将为细菌生命活动的荧光显微研究和流式检测提供有益的指导（Anal. Chem. 2012, 84, 1526）。此外，我们还发展了纳米金颗粒尺寸分辨和颗粒浓度无标样绝对定量分析及相对定量等快速表征技术。借助纳米金在532 nm的表面等离子体共振散射，HSFCM可以检测到单个24 nm的金颗粒，实现24 nm与48 nm纳米金颗粒的粒径基线分辨，当纳米金的粒径在20－50 nm范围时，单个纳米金颗粒的散射光强度随粒径的7.44次方衰减，与瑞利散射定律有较好的一致性。HSFCM检测体系的纳米颗粒检测效率接近100%，通过单位时间颗粒计数和样本体积流量的测定，我们创建了纳米颗粒浓度无标样绝对定量分析新方法（J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 12176）。该方法具有快速（1－2分钟）、简便、灵敏，不受限于颗粒的形状，无需了解材质的密度等特点，解决了形状不规则、复合、杂化纳米粒子的浓度难以准确测定的问题。