力学刺激下纳米银对受损前交叉韧带修复作用的影响及机制研究

Rupture of the anterior cruciate ligament (ACL) is a common knee injury which does not heal satisfactorily and would result in knee instability, pain, and even progressive degeneration of other joint structures. The most promising treatment for ACL injury is reconstruction which will later develop several complications. Therefore, it is imperative to find new approaches for improving the self-repair ability of injured ACL. It was reported that mechanical stimulation and silver nanoparticles (AgNPs) which is an an antimicrobial agent have potential to promote skin,tendon and bone repair, but the effect of AgNPs and mechanical stimulation on the ACL is less studied, especially for study about tissue repair of AgNPs to ACL, which has not been reported. Adopting the in vitro and in vivo experiments method combine together, this research intends to analyze the repair of rat ACL to AgNPs and mechanical stimulation in terms of cell proliferation and migrate, collagen synthesis and alignment, LOXs and MMPs expressions, MMP-2 activity and tensile strength by using real-time PCR, western blot, gelatin zmography, immunohistochemistry and biomechanical test, and so on. To conclude, this study will not only provide additional insight into the role of AgNPs in the process of tissue repair, but also will provide the basal data for repair of ACL in clinical trial.

前交叉韧带（ACL）断裂是发生率较高的运动创伤，损伤后无法自行修复，容易造成关节不稳，疼痛，甚至导致其它关节组织的退行性病变。目前治疗ACL损伤的唯一手段是韧带重建手术，但易引发并发症。因此寻找提高ACL自我修复能力的新路径势在必行。研究报道力学刺激与具有抗菌作用的纳米银能够促进皮肤、肌腱和骨等结缔组织的修复，然而对ACL修复作用方面的研究很少，特别是纳米银对ACL的修复作用还未见相关报道。课题采用荧光定量PCR、Western blot、明胶酶谱、免疫组化以及生物力学测试等技术分别通过体外与体内实验研究了力学刺激下纳米银对细胞增殖、迁移、胶原合成与排列、ACL力学强度、LOXs和MMPs表达及活性的调控作用，进而探讨其对ACL的修复作用。此研究不仅为纳米银在组织修复中作用的研究开拓了新的视角，也为ACL损伤的临床治疗提供了理论依据。

前交叉韧带和后交叉断裂后不能进行自我修复，并影响关节稳定性，进而引发骨性关节炎。因此从韧带的愈合机制入手，探讨交叉韧带无法愈合的原因并寻找修复韧带的途径是很有必要的。本项目主要进行了以下4方面的研究：（1）研究了TNF-α和IL-1β对滑膜细胞中赖氨酰氧化酶(lysyl oxidases, LOXs)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)表达以及MMP-2活性的影响。结果显示TNF-α与IL-1β的结合不同程度抑制了LOXs的表达，却以协同方式大大促进了MMP-1,2,3的表达。明胶酶谱实验指出TNF-α和IL-1β的结合进一步以剂量和时间依赖性形式诱导了MMP-2活性的增加，且MMP-2活性高于TNF-α和IL-1β的单独促进作用。（2）研究了损伤性力学拉伸和TGF-β1对滑膜细胞LOXs和MMP-1,2,3表达以及MMP-2活性的影响。结果指出损伤性力学拉伸与TGF-β1共同作用，促进了LOXs（除LOXL-1）和MMP-1,2,3的表达，并且MMPs的上调程度大于LOXs的上调程度。此外，损伤性力学拉伸与TGF-β1结合，以时间依赖性方式大大促进了MMP-2的活性，明显超过了力因子单独对MMP-2的作用。为了探究损伤性力学拉伸和TGF-β1调控滑膜细胞中MMP-2表达的机制，研究加入NF-κB通路抑制剂Bay11-7082和Bay11-7085，结果显示损伤性力学拉伸和TGF-β1诱导的滑膜细胞中MMP-2的活性被抑制。（3）项目在分别建立ACL细胞与滑膜细胞共培养体系以及PCL细胞与滑膜细胞共培养体系，研究了损伤性力学拉伸与TNF-α对与滑膜共培养的ACL和PCL细胞中LOXs和MMP-1,2,3的表达的影响。结果显示滑膜细胞进一步促进了损伤性力刺激与TNF-α对ACL和PCL细胞中LOXs表达的下调及对MMP-1, 2, 3表达的上调。进一步的动物实验结果显示NF-κB信号抑制剂Bay11-7082能够显著降低MMPs表达。以上结果表明关节腔微环境紊乱造成的受损交叉韧带愈合过程中细胞外基质合成与降解的失衡，是造成交叉韧带无法自我修复的原因之一。（4）研究了力学加载与纳米银对前交叉韧带细胞的增殖、迁移以及细胞中胶原含量的影响。揭示了纳米修复受损交叉韧带的作用机制，为纳米银在临床韧带修复领域的应用提供理论依据。