钙敏感钾通道参与川芎嗪拮抗药物性耳毒机制的研究

The study is to investigate the antagonism of tetramethylpyrazine on stremptomycin induced ototoxicity.tetramethylpyrazine can ecrease the higher ABR threshold value induced by stremptomycin, and protect auditory sensation,but the mechanism is not clear.we hypothesis: 1) Tetramethylpyrazine can enheance regeneration and cell differentiation by accommodate [Ca2+]i, to decrease ototoxicity induced by.stremptomycin; 2) tetramethylpyrazine can activate and up-regulate the gene expression of Ca2+ sensitive K+ channel,to recovery cell function of OHCs.[Ca2+]i detection, patch clamp technique, RT-PCR, and so on will be used in this study.The study will provide new theory for mechanism of ototoxic deafness, and meanwhile provide methods for prevention and cure of ototoxicity.

本项目旨在探讨钙敏感钾通道在川芎嗪（TMP）拮抗链霉素（SM）耳毒性损伤的机制。前期研究证明TMP能降低SM引起的ABR听阈升高，保护听觉功能，但机制尚不清楚。我们假设：1）TMP通过调节细胞内钙离子水平，降低因SM引起的耳毒性损伤；2）TMP通过激活和上调OHC钙敏感钾通道的基因表达水平，恢复OHC细胞功能，促进OHC再生和增殖，修复因SM引起的耳毒性损伤从而保护耳蜗听觉功能。本项目以中医药理论为指导，运用现代医学手段，采用细胞内钙信号检测、膜片钳技术，结合RT-PCR等分子生物学技术和细胞组织检测技术，通过在体和离体实验证实1）、2）两种途径的存在及其与TMP抗SM耳毒的相关性。本项目对TMP拮抗AmAn耳毒损伤机制进行多层次的深入研究，推动中医药学科发展。将为药物耳毒性聋的病理发生提供新的理论依据并为其防治提供可能的新方法。

据世界卫生组织统计，全世界有轻度听力损失者近6亿，中度以上的听力损失者2.5亿。我国有听力障碍残疾人2057万，占全国人口的16.79‰，占残疾人总数的33.52%，其中七岁以下聋幼儿达80万。这些患者中大部分是由于后天应用药物，尤其是氨基甙类抗生素（AmAn）不当造成的。AmAn所产生的耳蜗毒性的发生率可以达到患者总数的20%。其耳毒性损伤包括前庭器官和耳蜗，前庭损伤的发生率大约15%，耳蜗损伤的发生率可达25%。AmAn耳毒性损伤机制及其防治一直是一个热门话题。尤其在我们这个发展中国家有必要继续深入认识和了解AmAn的耳毒性损伤机制，期望最终能够减弱甚至消除它的耳毒性副作用，治疗或防止AmAn耳毒性所导致的听觉功能损害，更好的发挥这类药物价格低廉、高效抗菌、不易产生耐药性的优点。.本项目采用了形态学、细胞内荧光测钙、膜片钳及分子生物学等技术手段，观察了SM耳中毒豚鼠耳蜗形态学改变、OHC胞内Ca2+浓度变化、钙敏感钾通道（BKCa）及基因表达、毛细胞凋亡等变化及其特点，同时应用川芎嗪注射液（TMP）加以拮抗。结果发现，SM组BKCa mRNA及蛋白表达明显减少，TMP+SM组表达明显高于SM组。同时在膜片钳实验中发现应用不同浓度的SM可以使外毛细胞IK和IKCa电流降低，并呈现剂量依赖关系；而应用TMP后能明显增大IK和IKCa。提示TMP可能通过增大K+通道电导而拮抗SM耳毒性作用。推测K+通道的孔道位置可能是链霉素的结合点。我们认为BKCa的激活开放造成的超极化对Ca2+有着负反馈调节作用，当BKCa表达减弱时会增加Ca2+内流，导致细胞内钙超载，引起大量ROS释放，从而造成耳毒性损伤。通过对实验结果的综合分析，对TMP拮抗AmAn耳毒损伤的可能机制得出如下结论：1）TMP通过调节OHC内Ca2+水平，降低因SM引起的耳毒性损伤；2）TMP通过激活和上调OHC钙敏感钾通道的基因表达，恢复OHC的功能，修复因SM引起的耳毒性损伤，从而保护耳蜗听觉功能。这一结论验证了我们最初的假说，为最终找到TMP拮抗SM耳毒性损伤的病因病机和相关途径，为进一步深入研究药物性耳毒的防治提供了新的理论依据。