FgMsb3生化功能及其调控禾谷镰刀菌致病过程的机制研究

GTPase activating proteins (GAPs) are negative regulators of Rab GTPases which are involved in inactivating Rab GTPases by promoting their GTPase activity. In mammalian and yeast cells identified GAPs containing TBC (Tre2/Bub2/Cdc16) domain. Our previously reported suggest that Rab GTPases play essential role in the development of head blight disease and mycotoxin production in Fusarium graminearum. Based on these findings, we used bioinformatics method to identify all the TBC domain proteins which as possible candidates of GAPs in F. graminearum and proceeded to generate gene deletion mutants and phenotypic analysis. Preliminary results obtained from our analysis showed that GFP-FgMsb3 is localized to the SPK (Spitzenkörper) and further revealed that FgMsb3 is essential for development and plant infection in F. graminearum. So we set out to use biochemistry, genetics and proteomic strategies to explore the biochemical function and pathogenesis of FgMsb3 of F. graminearum in this project. As a candidate GAP, this study will enable us to understand how FgMsb3 regulate FgRab GTPase in F. graminearum and provide an insight into how FgMsb3-FgRab GTPase coordinate to regulate pathogenesis by modulating polarized secretion in F. graminearum. Results of this project will provide a new strategy for wheat scab disease.

GTP酶激活蛋白（GAPs）作为Rab GTP酶的负调控因子。在哺乳动物及酵母中，已经鉴定的Rab GTP酶的GAPs均含有保守的TBC（Tre2/Bub2/Cdc16）结构域。申请人在系统研究明确Rab GTP酶对禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病及毒素产生起重要调控基础上，用生物信息学方法鉴定到12个含有TBC结构域的假定GAPs。基因敲除及表型分析后，发现其中一个蛋白FgMsb3定位于顶体，对禾谷镰刀菌的生长发育及其致病性至关重要。本项目拟通过生物化学、遗传学和蛋白质组学的方法对FgMsb3的生化功能及致病机制深入研究。阐明其具体调控哪些Rab GTP酶的水解；基于FgMsb3的定位特点，鉴定FgMSB3缺失突变体和野生型的差异分泌及互作蛋白质组，解析FgMsb3可能通过极性分泌来调控致病性的机制。这些创新性的研究可望明确禾谷镰刀菌FgMsb3基因的功能，为小麦赤霉病的防治提供新的策略。

禾谷镰刀菌是植物病原真菌，主要侵染小麦等禾本科作物引起赤霉病，其产生的真菌毒素DON污染粮食作物，并进一步通过食物链威胁到人类和牲畜的健康。GTP酶激活蛋白（GAPs）作为Rab GTP酶的负调控因子，在哺乳动物及酿酒酵母中，已经鉴定的Rab GTP酶的GAPs均含有保守的TBC （Tre2/Bub2/Cdc16）结构域。课题组在系统研究明确Rab GTP酶对禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病及毒素产生起重要调控基础上，用生物信息学方法鉴定到禾谷镰刀菌中12个含有TBC结构域的假定GAPs。基因敲除及表型分析后，发现其中一个蛋白FgMsb3定位于顶体，对禾谷镰刀菌的生长发育及致病性至关重要。我们进一步通过遗传学、生物化学及蛋白质组学等方法对FgMsb3的生化功能及其调控禾谷镰刀菌致病过程中的作用机制展开研究。遗传学实验证明FgMsb3中的TBC结构域、R681氨基酸残基及168-399氨基酸序列是其发挥功能的主要功能域及位点。活细胞成像结果表明FgMsb3调控SNARE蛋白FgSnc1介导的囊泡外泌过程。体外水解酶活性结果暗示着FgMsb3蛋白C端的TBC结构域可与激活态的FgRab8互作并将其水解成失活态的FgRab8，以维持FgRab8活性的动态平衡，该平衡破坏后，会影响禾谷镰刀菌的极性生长、毒素合成、致病性及分泌囊泡的极性分泌。利用蛋白组学方法，我们筛选到FgMsb3假定的互作蛋白极体复合体核心组件FgSpa2。酵母双杂交、BiFC及共定位实验均证明FgMsb3与FgSpa2直接互作。进一步我们发现FgSpa2通过其SHD结构域招募FgMsb3蛋白N端的一段未知结构域（氨基酸残基168-399）至菌丝尖端顶体部位进而发挥功能。综上所述，本研究首次在植物病原真菌中系统鉴定了极体复合体核心组件FgSpa2精准协调FgMsb3-FgRab8介导的囊泡极性分泌过程，丰富了囊泡分选转运在植物病原真菌中的研究，为未来利用囊泡的精准分选机制研发新型杀菌剂或生物制剂提供理论指导。