LMoV和CMV外壳蛋白对百合叶绿体功能的影响及机制

Lily (Lilium spp.) is an important economic crop in the floricultural industry ,and further value is obtained from the bulbs, which are edible and also have medicinal properties. Almost all lilies are propagated vegetatively, and virus infected bulbs used for forcing may propagate diseases from one generation to the next. Viruses cause quantitative and qualitative yield reduction of lily worldwide. Two frequently occurring viruses in many Lilium species are Lily Mottle Virus (LMoV) and Cucumber Mosaic Virus (CMV), and mixed infections of these two viruses have been confirmed in various lily species, resulting in more severe disease symptoms than those produced by single infections. In this study, we plan to adopt the following methods and techniques including two-dimensional electrophoresis (2-DE) method, western blotting method, immunogold labelling techique, immunofluorescence technique, and mass spectrometric identification of protein technique to study three aspects of the coat proteins of LMoV_ (LMoV-CP) and CMV_ (CMV-CP): (1) the accumulation and location of LMoV-CP and CMV-CP in intact lily chloroplasts isolated from leaves inoculated with either LMoV, CMV or a mixture of LMoV + CMV; (2) the import into intact chloroplasts (in vitro) of LMoV-CP, CMV-CP and the mixture of LMoV-CP + CMV-CP; and (3) the photochemical activity and proteome of the thylakoid membrane, which is affected by LMoV-CP, CMV-CP and the mixture of LMoV-CP + CMV-CP. This study will determine the mechanism of function of lily chloroplasts affected by LMoV-CP, CMV-CP, and the mixture of LMoV-CP + CMV-CP, and any differences as a result of influence by these coat proteins. In addition, it will provide a theoretical basis for virus disease control and virucides development of lily.

百合是一种集观赏、食用、药用价值于一身的重要经济作物，长期无性繁殖使病毒不断积累，严重影响了产量和品质，其中百合斑驳病毒（LMoV）和黄瓜花叶病毒（CMV）是普遍发生的两种病毒，且这两种病毒多以混合感染的形式出现，导致比单一侵染更加严重的症状。本研究拟以LMoV和CMV两种病毒的CP为研究对象，采用双向电泳、western blotting、 免疫金标记、荧光免疫以及质谱鉴定等方法和技术进行单一及混合感染后LMoV-CP和CMV-CP在百合叶绿体中的积累及细胞定位、LMoV-CP和CMV-CP在叶绿体中的离体跨膜运输以及对离体类囊体膜光化学活性和蛋白质组的影响研究，明确LMoV-CP和CMV-CP对百合叶绿体功能的影响及机制，比较单一及混合的LMoV-CP和CMV-CP 对百合叶绿体功能影响机制的差异，为百合病毒病的防治及抗病毒药剂的研发提供理论依据。

侵染百合的病毒有20多种，其中百合斑驳病毒（LMoV）和黄瓜花叶病毒（CMV）是普遍发生的两种病毒，且这两种病毒多以混合感染的形式出现，导致比单一侵染更加严重的症状。由于缺乏病毒感染尤其混合感染的致病机理等的研究，使得现阶段对百合病毒病的防治非常盲目，又由于花叶型病毒CP与寄主花叶症状的产生密切相关，因此本研究主要以LMoV和CMV的CP为研究对象，采用RT-PCR、胶体金速测、Western blotting、免疫金标记等方法和技术进行百合主要病毒分子检测、病毒感染对百合光合生理的影响、单一及混合感染后LMoV-CP和CMV-CP在百合叶绿体中的积累及细胞定位、LMoV-CP和CMV-CP在叶绿体中的离体跨膜运输研究等，明确LMoV-CP和CMV-CP对百合叶绿体功能的影响及机制，为百合病毒病的治理和抗病毒药剂的研发提供理论依据。取得的主要结果如下：.1. 开发了百合6种病毒ELISA、RT-PCR、Real-time PCR和胶体金检测的技术体系，建立了从定性-半定量-定量的检测平台，使百合病毒检测从8h、100元/样缩短到5 min、2-3元/样；.2. 开发了防效显著的百合抗病毒技术，筛选出了目前国内唯一适用于大田的百合抗病毒制剂AZ，对百合主要病毒CMV复制的抑制效果达90%；.3. 证实了感病叶片的LMoV 外壳蛋白（CP） RNA相对含量与光合色素含量以及总酚和类黄酮浓度之间呈二次函数的关系。.4. 发现与LMoV单一侵染相比，LMoV+CMV复合侵染显著影响了百合生长和光合色素含量，明显破坏了叶绿体超微结构。.5. 首次在百合上证实了无论单一还是复合侵染，LMoV-CP和CMV-CP都存在于感病百合叶绿体及类囊体膜上，且这两种病毒的CP都很容易跨膜进入百合叶绿体；也发现LMoV和CMV跨膜进入百合叶绿体存在着种属特异性，LMoV-CP和CMV-CP均不能进入到LMoV和CMV的非寄主（小麦、菠菜、烟草和大蒜）的叶绿体中。.6. 发现当LSV单一或者LSV+LMoV复合侵染时，LSV-CP均不能跨膜进入到百合叶绿体，但是LSV+CMV复合侵染后，LSV＞10μg/mL时 LSV-CP即能跨膜进入到百合叶绿体。. 以上结果，为解决严重制约百合产业发展的种源退化问题提供了重要的技术支撑，也为深入研究百合病毒的致病机理奠定了良好的理论依据。