基于压力响应机制构建大肠杆菌异源合成硫代葡萄糖苷新途径

Glucoraphane are sulfur- and nitrogen-containing plant secondary metabolites common in the Brassicaceae. As the precursor of natural anti-cancer substance sulforaphane, there is high market demand for Glucoraphane. Glucoraphane are mainly produced by extracting from Brassicaceae plants instead of chemical synthesis and depended on limited sources. No microbial production method was reported yet. The biosynthetic pathway in E.coli was established according to the principle of synthetic biology in this study. The heterologous expression for product was achieved by assembling 12 enzymes trough 3 modules. The inter-module suitability and compatibility between module and substrate were adjusted. The key metabolic process was found through transcriptomics and proteomics study and rate-limiting enzymes was also completed. Through positive and negative selection, target gene in E. coli were replaced by exogenous gene through gene recombination technology. Meanwhile, the genes in competitive branch were deleted or down-regulated to achieve high-yield production of glucosinolates. Based on cellular stress response mechanism, sensitive gene was screened and stress-response promoters were constructed and the gene expression sequence was changed to reduce the toxic effect to cells caused by accumulation of toxic intermediate metabolites cause cells to reach maximize the accumulation of glucosinolates. The study provides new insight for Microbial molecular breeding research and lay the theoretical foundation for the genetic transformation of other large industrial strains.

硫代葡萄糖苷是十字花科植物中一组重要的富含氮硫的阴离子次生代谢物质，作为抗癌天然产物莱菔硫烷的前体，市场需求量大，目前化学合成困难，多提取自十字花科植物，来源有限，且尚未有微生物生产的报道。本研究拟利用合成生物学原理在大肠杆菌中构建其生物合成途径，通过3个模块将12个酶进行组装，实现产物的异源表达；调节模块间、模块与底物间适配性，利用转录组学，代谢组学方法找到关键代谢节点，进行限速酶的定向进化；通过正负筛选，将部分外源基因通过重组技术与大肠杆菌基因组中需删除基因替换，同时删除或弱化竞争性支路的基因，达到高产硫代葡萄糖苷的目的；基于细胞压力响应机制，筛选敏感基因，构建压力响应型启动子，调节基因表达时序性，减少中间代谢物积累对细胞造成的毒害，达到最大化积累硫代葡萄糖苷的目的。研究为微生物分子育种提供新思路，同时为其他大宗工业菌种的遗传改造奠定理论基础。

硫代葡萄糖苷是十字花科植物中一组重要的富含氮硫的阴离子次生代谢物质,作为抗癌天然产物莱菔硫烷的前体,市场需求量大,目前化学合成困难,多提取自十字花科植物,来源有限。本研究尝试了首次在大肠杆菌中生产硫代葡萄糖苷，并构建了相关代谢通路。.首先，我们通过对同工酶的筛选，确定了对于甲硫氨酸作为底物，来自于拟南芥的LSU、SSU和IPMDH1比来自于大肠杆菌的leuBCD及ilvE具有更高的催化活性。优化了两个细胞色素CYP450家族的酶，CYP79F1和CYP83A1，的原核表达条件；同时考量了两种CYP450还原酶的功能，通过构建融合蛋白，实现了CYP79F1和CYP83A1在大肠杆菌中的表达且具有催化活性。基于上述研究，最终成功在大肠杆菌中实现了硫代葡萄糖苷的生物合成。.对糖基转移酶进行了研究，发现了一种可以生产熊果苷的糖基转移酶，通过逆向代谢工程方法首次成功的实现了熊果苷的生物合成，最终摇瓶产量达到4.2g/L。以此为基础，构建了以对羟基苯甲酸为前体的芳香族化合物大肠杆菌生产平台。通过对对羟基苯甲酸羟化酶的理性设计与改造，在大肠杆菌内实现了没食子酸的生物合成，摇瓶产量达到1.2g/L。鉴定了一个新的2,3-二羟基苯甲酸羟化酶，解决了在焦性没食子酸生产过程中的脱羧问题，以一条高效的全新途径生产了焦性没食子酸，摇瓶产量达到1.04g/L。利用研究中已经成熟的对羟基苯甲酸高产平台，引入新的对羟基苯甲酸羟化酶等三种酶，实现了香草醇的生物合成，摇瓶产量达到240.69mg/L。研究了在微生物生产高附加值产物的过程中酰基辅酶A的降解对于产物生产的影响，建立了酰基辅酶A降解酶的筛选平台，并将该平台应用于抗血栓药物的生物合成过程中，使4-羟基香豆素的产量提高300%，最终得到了935mg/L的4-羟基香豆素。.另外，对CYP450家族的同工酶进行了研究。将厌氧条件下具有催化活性的烯酮还原酶在好氧条件下表达，表征了该酶可以催化肉桂酸及p-香豆酸生产3-苯基丙酸和3-4-羟基苯基丙酸，基于此，建立了这两种物质在大肠杆菌中的异源合成途径。.研究共发表文章13篇，其中本领域TOP文章10篇，全面完成了项目计划。