梨‘中矮1号’IAA氧化酶基因分离与致矮作用研究

'中矮1号'是我所培育的我国第一个具有自主知识产权的梨矮化砧木，在梨矮化栽培中发挥着重要作用，但其致矮的分子机理尚不清楚。本课题组根据前期研究结果推测'中矮1号'矮化砧致矮与其IAA氧化酶活性较高有关。IAA氧化酶属于第Ⅲ类过氧化物酶家族，其成员众多，基因结构相似。本项目拟利用RT-PCR、RACE等技术同源克隆梨'中矮1号'过氧化物酶家族基因；并将所获得的全部基因分别进行原核表达，根据原核表达产物对IAA的降解水平来筛选具有IAA降解活性的IAA氧化酶基因；通过对'中矮1号'不同嫁接形式下IAA氧化酶基因的时空表达及其酶活性、激素含量等的分析，以及转过表达IAA氧化酶基因烟草植株嫁接后的株型表现，确定IAA氧化酶基因与'中矮1号'致矮作用的关系。本项目旨在揭示'中矮1号'矮化砧致矮的分子机理，对于梨矮化砧木的分子育种具有重要意义。

本项目以‘中矮1号’韧皮部为试材，用在南瓜和葡萄中已报导的可能具有IAA氧化酶活性的基因CAA76680.1和AAQ55292.1为模板，同源检索苹果基因组，以与已知基因氨基酸序列相似性较高的苹果基因组对应的基因序列设计特异引物，在梨中进行了扩增，获得了3个过氧化物酶基因。其中2个基因具有完整编码框，氨基酸序列与苹果同源序列相似性分别为96.76%和92.45%，命名为PcPox1和PcPox2，基因登录号分别为KC153029.1和KC153030.1。对其表达情况进行了初步分析，结果表明这2个基因在‘中矮1号’韧皮部中的表达量比在叶片中的高。同时，为这2个过氧化物酶基因分别构建含报告基因（GUS和GFP）和不含报告基因植物过表达载体，获得了重组质粒。进一步的功能验证和遗传转化工作正在进行中。. 以‘中矮1号’新梢叶片为试材，以其母本‘锦香’为对照进行了1个转录组测序分析。通过序列拼接和分析，获得了一些在2个品种中具有明显表达差异且可能与矮化相关的基因，包括可能与GA、IAA、ABA、BR和乙烯等激素的合成、转运或信号转导相关的基因，与水分相关的基因，NAC和WRKY转录因子，过氧化物酶基因和E3泛素蛋白连接酶基因等。这些基因在‘中矮1号’的表达均显著不同于对照，可能在其生长发育中起到重要作用，对其中的3个基因做了深入研究。1个可能参与赤霉素的合成的GA3-β双加氧酶基因，在‘中矮1号’中低表达，在其启动子上发现1个YABBY转录因子结合位点，其调控模式正在研究中。1个可能具有转运生长素功能的生长素氢转运体基因，在‘中矮1号’中低表达，其启动子上存在1个58 bp片段缺失和P-box转录因子结合元件，可能是其表现表达差异的原因。1个参与蛋白质降解的E3泛素蛋白连接酶，在‘中矮1号’中各时期均高表达，为其构建了过表达和苹果同源基因的干涉载体，进一步的功能验证和靶蛋白分析正在进行中。. 此外，还进行了贝壳杉烯酸氧化酶基因的克隆和表达分析及组织培养等相关工作。发现贝壳杉烯酸氧化酶基因在‘中矮1号’新梢停长前后低表达，可能影响赤霉素合成；筛选出了4个叶片再生率大于80%的梨品种或株系。. 根据上述研究内容在中文期刊上发表论文4篇，在《园艺学报》和《PLOS ONE（Online）》期刊各投稿论文1篇，目前投稿文章正在审理中，培养研究生3