基于流动进样-质谱的高通量细胞代谢组分析方法的研究

High throughput metabolomics platform for cultured cell has an arisen requirement of application in the area of life science. The major encountered problem is the analysis of global cellular metabolome under a robust and sensitive strategy. Therefore, the presented project aimed at developing a novel flow injection based metabolomics strategy using nano liquid chromatography coupled to an Orbitrap MS, which may provide a higher sensitivity with lowered ion suppression effect. To decrease the influence of ions with high concentration, the analysis would be performed under two levels. Thus the metabolites with lower concentration would be detected without the existence of higher concentration metabolites. For the detection of trace metabolites, derivatization would also be applied to improve the ionization and intensity. And the subsequently MS analysis would be performed with a combined strategy of 'top down' and 'bottom up', which could provide more information of the metabolites and their fragmentation. Finally, new data processing method would be developed according to the high resolution MS and MS/MS data, removing the noises and exploring valuable metabolic information. Under the presented strategy, the covered dynamic range of cell metabolome would be expected to nearly 5-6 order of magnitude. The execution of the presented project would provide not only solutions for cellular metabolomics problems but also a useful strategy for the analysis of complex system within biological matrix.

高通量细胞代谢组分析在生物医学等多个领域都有迫切的应用需求。提高通量，并扩大代谢物检测范围是目前其方法学研究面临的主要问题。本项目拟建立一套基于高分辨质谱及纳升液相色谱进样系统的细胞代谢组高灵敏快速分析方法，针对上述问题，本项目拟改进代谢物前处理方法并结合分层次分析的策略，减少离子抑制效应对低丰度代谢物分析的影响，并以在线衍生及重要代谢物靶向监测的方法实现痕量代谢物分析。同时，在质谱方法上结合top down与bottom up的策略，以代谢组快速非靶向分析及代谢物的靶向提取的方式，提高分析覆盖的代谢物浓度动态范围至5-6个数量级。随后，通过发展数据处理方法发掘海量质谱数据中有效的代谢物信息，并进行结构确认。最后，该方法将在肝癌细胞代谢网络构建的研究中加以应用及验证。本项目的实施，在促进细胞代谢组研究、满足相关领域应用需求的同时，也为复杂体系的高通量分析提供新的思路。

生物体受外界扰动后引起的代谢物质和量的变化是代谢组学关注的主要目标。细胞代谢是代谢组学研究的重点领域之一。然而，受检测仪器水平所限，代谢物的灵敏度一直是影响细胞代谢轮廓分析数据结果的主要因素。如果想获得一个对细胞代谢的整体了解，必需培养细胞达一定数量，然而，大量细胞的培养耗时、费力，严重制约了获取代谢组数据的通量，使得一些相对规模较大的研究无法开展。另一方面，目前的高通量细胞筛选方法虽然可以在96孔板上进行，但是检测的靶标往往是少量几个代谢物，无法实现对代谢通路覆盖的目标。综合上述问题，本研究的目标为以96孔板培养的细胞为研究对象，建立一套基于高分辨质谱并可涵盖大部分胞内代谢物的高通量分析方法。通过对代谢物预处理及分析策略的综合运用，实现对细胞内重要的代谢物的快速测定。我们发展和评价了淬灭提取一步完成的高通量的96孔板细胞预处理方法利用，结合灵敏的氨基丹酰化方法，实现了基于LC-MS的细胞胞内氨基酸轮廓高通量分析方法。通过对该方法的线性，日内，日间精密度的考察以及对从种板，细胞生长至预处理，后续分析的整个流程作了重复性、回收率考察，证明了该方法的可行性。最后将该方法用于hepG2细胞的脂肪酸干预实验中。本方法由于细胞用量少，通量高，除了在探索重要代谢物功能外，在干细胞研究，快速药物筛选等领域也具有很好的应用前景。