TLR7配体Imiquimod促进胶质瘤干细胞自我更新的作用及机制研究

Glioma stem cells (GSC) have strong ability of self-renewal, proliferation and differentiation, and play an important role in the development and recurrence of malignant glioma. Several studies identified that the Toll-like receptor (TLR) family as critical players in the occurrence and development of certain tumors, which have not been reported in GSC. Our preliminary study found that Toll-like receptor 7 (TLR7) is highly expressed in GSC, and tumor sphere-forming ability of GSC can be promoted by TLR7 agonist, Imiquimod (IMQ ).Interstingly, GSC cells showed substantially increased secretion of interleukin 6 (IL-6). Combining with the investigation of inflammatory microenvironment in tumor progression, we speculate that self-renewal ability of GSC may be regulated by TLR 7 mediated signaling via induction of proinflammatory cytokines. According to our previous, we intend to adopt the GSC derived from glioma cell lines and glioma patients as the research objects, identify the regulatory mechanism of promoting of GSC self-renewal after stimulation of TLR7 agonist, and the role of IMQ through the method of immunology and molecular biology. This will lead to new targets in the treatment of malignant glioma.

胶质瘤干细胞（GSC）具有强大的自我更新、增殖和分化能力，是恶性胶质瘤发生、发展及维持的罪魁祸首，更是术后复发的主要原因。目前发现Toll-like Receptor（TLR）家族成员在某些肿瘤发生发展中起重要作用，但在GSC中的研究尚未报道。本项目组前期研究发现体外无血清培养的GSC高表达TLR7，其配体Imiquimod（IMQ）可以促进GSC自我更新，同时IMQ刺激后培养上清中检测到了高水平IL-6。结合肿瘤炎性微环境与肿瘤发生发展的研究，我们推测IMQ可能通过激活TLR7信号通路，诱导分泌促炎性细胞因子，从而促进GSC的自我更新与增殖。本课题将对这一假设进行研究，并对该过程中相关信号转导途径的参与机制进行初步探讨。 本课题的完成将揭示TLR7信号通路与GSC自我更新的内在联系，为恶性胶质瘤的复发找到新的可能原因，同时为发掘新的GSC干预治疗靶标提供理论依据。

胶质瘤干细胞（GSC）具有强大的自我更新、增殖和分化能力，是恶性胶质瘤发生、发展及维持的罪魁祸首。已有文献报道，胶质瘤细胞表达Toll-like Receptor（TLR）家族成员，但是表达于GSCs的TLRs有哪些，其配体药物对GSCs生物学作用及其机制需要进一步探讨。我们首先检测普通胶质瘤和GSCs上TLRs的表达情况，发现的GSCs高表达TLR7，然后进一步研究TLR7配体Imiquimod对GSCs增殖和自我更新能力的影响，并探究其中分子机制，我们还分析了TLR7信号重要蛋白与Imiquimod促进GSCs增殖和自我更新之间的关系。主要结论如下：.1、与正常胶质瘤相比，经过干性鉴定GSCs表达TLR7的水平更高。运用成球实验、极端有限稀释法和Edu掺入实验等多种方法证实Imiquimod可提高GSCs的成球和增殖能力，运用Western blot和流式细胞术证实Imiquimod处理GSCs可提高干细胞标志性分子表达水平，并激活IL-6-STAT3信号通路；此外，用Imiquimod处理正常胶质瘤细胞，可诱导胶质瘤细胞处于慢周期状态，同时促进ALDH1和CD133表达，提高了细胞干性。.2、通过mRNA测序发现GDF15和LIF在Imiquimod诱导GSCs增殖和自我更新过程中表达上调，沉默GDF15可逆转Imiquimod对GSCs的作用，人工合成GDF15刺激能够诱导GSCs增殖和自我更新；LIF参与Imiquimod促进GSCs增殖和自我更新的调控，中和LIF逆转Imiquimod对GSCs的作用；GDF15通过LIF-STAT3促进GSCs增殖和自我更新，GDF15促进LIF的转录表达不依赖SMAD信号途径。.3、运用siRNA干涉TLR7和MyD88的表达，证实Imiquimod诱导提高GSCs中Ki-67表达和STAT3磷酸化是由MyD88介导的，并不依赖TLR7；此外，证实其他TLR7配体CL075和CL097不能提高GSCs的成球能力，对IL-6的分泌没有影响，因此，推测Imiquimod对GSCs的作用，并不依赖其与TLR7的结合。. 本课题的完成，将有助于我们从新审视Imiquimod作为肿瘤疫苗佐剂的可能性，将揭示GDF15-LIF对GSCs增殖和自我更新的调控作用，为发掘新的GSCs干预治疗靶标提供理论依据。