基于GWAS筛选结果精细定位鸡胫色转化调控的关键基因

Chicken shank color conversion refers to the process that the yellow color converts to the black, which prevented the application of the Z chromosome melanin inhibitory gene to establish male and female self recognition lines in Ma / Huang featherChinese local breedschickens. Based on the results of GWAS screening, the 20thchromosome 2Mbp was sequenced and mapped by region capture chip. The genes in the region will be screened. The transcriptome sequencing will be used to analyze the differential expression genes in shank skin tissues of color transformed and untransformed chickens. Genesselected by the two methods will beimportant candidate genes.Combining with the existing gene function results, key genes that regulate shank color conversion will be identified. Gene regulatory network will be built through GO, KEGG analysis. Causitive mutations that regulating shank color conversion at the cellular level will be investigated by using luciferase, EMSA and CHIP-PCR assays, to analyze the effects of mutations on gene expression levels and protein activity. Jingyang chicken will be used to conduct association analysis to determine the molecular markers for the shank color conversion. The output of this proect will offer new genes and markers for using shank colortorecognize male and female in thelocal chicken breeds.

鸡胫色转化是指成年表现为黑色胫，出壳时胫色是黄胫，在生长过程中存在胫色由黄变黑的转化过程，它严重干扰了麻/黄羽的中国地方品种鸡利用Z染色体黑色素抑制基因建立自别雌雄的应用。项目基于GWAS筛选结果，针对20号染色体2Mbp的鉴定区域，用区域捕获芯片进行基因组区域捕获测序和精细定位，挖掘区域内基因；用转录组测序对比分析胫色转化与不转化的鸡胫皮肤组织差异表达基因；联合分析两种方法都筛选到的基因作为重要候选基因，结合已有的基因功能研究结果，鉴定调控胫色转化的关键基因。通过GO、KEGG分析，鉴定其基因调控网络。通过荧光素酶、EMSA、CHIP-PCR等分析突变位点对基因表达、蛋白活性的作用，在细胞水平验证调控胫色转化的关键基因及关键突变位点。用景阳鸡等胫色有转化现象的鸡群对关键突变位点与转化表型进行关联分析，确定高效甄别控制胫色转化的分子标记，为地方鸡创建利用胫色自别雌雄的配套繁殖奠定基础。

胫色转化的基因座使利用胫色自别雌雄的使用受到限制。发掘调控鸡胫色变化和胫色不变相关基因，能够诠释贮胫色转化的基因调控网络，筛选出高效甄别胫色转化与胫色不变相关联的分子遗传标记，为利用胫色创建自别雌雄配套系奠定基础。在本基金的支持下，课题组系统研究了鸡胫色转化与非转化的调控机理，利用资源群体的GWAS结果与经典方法相结合发现了一个与ID基因座高度吻合插入/缺失变异，为理解胫色调控提供了实验依据。.重要研究成果有：对6816只江汉鸡胫色的研究发现，在没有E位点的影响时，所有出壳雏鸡的胫色均为浅色胫，胫色转化是普遍现象；利用GWAS的结果，在该关联 SNP 点附近选择了候选区间（78.69Mb-78.74Mb）进行结节无缝链接一代 PCR 扩增重测序，总扩增长度约为55kb，发现在chrZ:78,723,154-78,723,746bp（galGal5.0）内有一处143bp缺失/插入与高GC区域差异相叠加的序列变异，疑似可代表ID基因座，在资源群体中与胫色极显著关联；疑似ID/id序列启动活性实验结果表明，该区段具有启动活性且代表ID的缺失片段的启动活性显著高于代表id的插入片段，与ID基因座的遗传规律相符；结合RNA-seq、HI-C数据及相关基因功能的注释推测，疑似ID基因座的片段通过调控CDKN2A基因表达完成对胫色的调控，符合ID基因座基因的作用方式；为验证候选区域对胫色调控的影响，设计了CRISPR/cas9双敲除系统敲除黑胫候选区域序列，在细胞水平上成功实现了序列编辑；利用ID基因座的遗传原理，结合FM、E位点的综合影响使透射光谱在通过鸡胚时由于胫色差异引起透射率的不同，可以进行鸡胚无损雌雄鉴别。.本课题研究成果对胫色转化提出来新诠释，为理解胫色变异提供了分子生物学基础，为实现鸡胚发育中前期的11-13日龄在蛋壳中进行无损雌雄鉴别提供了部分实验基础。