锰致神经细胞递质、神经退行性变相关蛋白和死亡机制的综合研究

锰是环境主要污染物之一，慢性锰中毒主要引起神经系统损害，表现为类帕金森氏病症状。尽管已发现锰的神经毒性机制以线粒体为重要环节，涉及氧化应激、钙稳态失衡、多巴胺耗竭和兴奋性递质毒性、神经元死亡等多种途径，但锰致神经系统损伤的机制尚未完全阐明，尚存在缺口，仍需深入及整合研究。本课题在细胞、分子和整体动物水平，从神经递质代谢、线粒体应激、神经退行性蛋白、神经元与星形胶质细胞间交互作用以及细胞死亡方式间交互作用的角度对锰神经毒性进行综合研究，包括：①锰引起多巴胺神经元多巴胺递质耗竭和兴奋性递质毒性两种机制间的关联；②锰中毒与退行性相关蛋白质的关系；③多巴胺能神经元和星形胶质细胞交互作用在锰神经毒性中的意义；④锰中毒发病过程中多巴胺能神经元死亡方式间交互作用及分子机制，以期进一步阐明锰神经毒性的靶分子-途径-网络机制，确定锰神经毒作用的关键事件和毒作用模式，为锰中毒防治提供理论依据。

锰是一种神经毒物，长期接触过量的锰会导致神经损害。本课题从线粒体应激、神经递质代谢、神经退行性蛋白、神经元与星形胶质细胞间交互作用以及细胞死亡方式间交互作用方面对锰神经毒性进行综合研究。首先，本课题以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为神经元模型，研究发现MnCl2呈剂量-时间依赖性引起细胞内Ca2+含量增加，线粒体膜电位下降、活性氧（ROS）增加，并且MnCl2可升高酪氨酸羟化酶（TH）和降低磷酸活化谷氨酰胺酶（PAG）的活性，降低多巴胺递质转运体（DAT）和谷氨酸转运体VGluT1的表达，降低氨基丁酸转运体（GAT）表达，表明MnCl2可引起神经细胞线粒体损伤、氧化应激，并可降低细胞内酶活性、干扰神经递质转运，从而引起神经递质紊乱。本课题进一步以SH-5Y5Y细胞和大鼠原代培养的星形胶质细胞建立Transwell共培养体系，对MnCl2致神经细胞的线粒体损伤、氧化损伤及神经递质进行研究，结果发现，共培养体系中MnCl2可引起星形胶质细胞过度活化，其可加重锰致SH-SY5Y细胞的氧化损伤，线粒体应激及细胞凋亡，且Akt凋亡信号通路参与其中。共培养体系中，MnCl2可进一步升高SH-SY5Y细胞内TH的活性；而增加PAG的活性，且MnCl2可降低DAT和VGluT1的表达，而增加GAT表达，这些结果表明，在MnCl2引起神经细胞线粒体损伤、氧化应激，及干扰神经递质合成及转运方面，星形胶质细胞与多巴胺能神经元存在交互作用。以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为神经元模型，本课题研究发现MnCl2可诱导SH-SY5Y细胞PINK1和Parkin及a-syn蛋白表达，表明神经退行性变相关蛋白可参与锰神经毒性，进一步研究发现PINK1/Parkin可以增加线粒体功能、抗氧化，在锰的神经毒性中起保护作用。本研究发现锰可呈剂量依赖性引起细胞自噬-凋亡-坏死，PINK1/Parkin下调或3-MA分别抑制线粒体自噬和细胞自噬，可增加MnCl2引起的细胞凋亡，表明自噬在MnCl2引起的神经细胞死亡过程中发挥保护作用。本课题通过整体动物实验进一步验证了体外实验的结果。0.5 mM低剂量MnCl2作用细胞24 h后基因表达谱芯片结果发现，锰可引起773基因上调143个基因下调2倍以上，其中涉及到细胞分子功能、生物进程及细胞成分等各个方面。