Notch对猪肌卫星细胞增殖与分化的调控及其分子机理研究

Notch是脊椎动物发育十分重要的信号受体家族，其信号通路是调控胚胎形成期及成年阶段肌卫星细胞激活和增殖的主要途径，对肌纤维的形成和发育具有重要调控作用。本项目首先分离培养1日龄长白猪的肌卫星细胞，RT-PCR检测肌卫星细胞中表达的Notch受体，构建Notch受体基因RNAi载体，转染肌卫星细胞，定量PCR检测靶基因Hes1、Hes5表达量的变化，确定Notch受体的关键基因；构建Notch受体关键基因的超表达载体，转染肌卫星细胞，检测Notch超表达和RNAi后肌卫星细胞的活力，定量PCR及Western Blot检测周期蛋白（CCNB1、 CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、p21）和MyoD家族表达量的变化。从而明确Notch对猪肌卫星细胞增殖和分化的作用，解析Notch调控猪肌卫星细胞增殖与分化的分子机制，为猪产肉力性状的遗传改良奠定分子生物学基础。

猪骨骼肌卫星细胞在猪肌肉发育调控过程中发挥着至关重要的作用。本项目通过组织剪碎法和二次差速贴壁法分离和纯化猪原代猪骨骼肌卫星细胞，通过RNAi技术和荧光定量PCR检测法明确了Notch通路调控猪骨骼肌卫星细胞的关键受体为Notch1， 关键靶基因为Hes5。分别激活和干扰Notch信号通路后，通过流式细胞术以及免疫荧光技术检测发现，Notch信号通路能够促进猪骨骼肌卫星细胞的增殖，抑制其分化；同时，通过荧光定量PCR和Westernblot检测成肌调节因子家族和周期蛋白家族基因表达，发现Notch信号通路是通过抑制MyoD、Myogenin和P21的表达，上调CCNB1、CCND1和CCND2表达实现对猪骨骼肌卫星细胞的调控。另外，添加力生长因子MGF能显著下调Myogenin表达，上调细胞周期蛋白CCNB1、CCND1、CCND2、CCNE1表达量、下调细胞周期负调控蛋白P21表达量，促进猪骨骼肌卫星细胞增殖，抑制其分化。此外，在检测蓝塘猪和长白猪胚胎期49天、77天、91天和出生后2天的肌肉组织基因表达后发现，E49和E77时期，可能是Notch信号调控蓝塘猪肌肉生长发育的重要时期，而E91则可能是Notch信号调控长白猪生长发育的主要时期。通过本项目的研究，明确了Notch信号通路对猪骨骼肌卫星细胞的影响，并揭示了其中的分子调控机制，为更加全面深入的理解猪骨骼肌发育机制以及提高猪产肉力研究提供了可靠的研究数据和基础。