附着捕获序列的水凝胶微珠在液滴单细胞测序中的应用研究

With the rapid development of sequencing technology, single cell-based sequencing has become one of most desired methods in this field. Researchers have developed a variety of methods based on single-cell sequencing. However, not only the throughput is low, but also the cost is very high. Therefore, a high-throughput and low-cost single-cell sequencing still remains great challenges. Microfluidic technology provides a promising platform for high-throughput single-cell sequencing. Microfluidic chip can generate thousands of droplets as microreactors. Each droplet can encapsulate a single cell and a barcoding bead, which the bead will capture the DNA or RNA from the cell. However, the cells and beads encapsulation follow the Poisson distribution, which become the key limitation issue of Drop-seq technology. In order to beat the Poisson distribution, this project we plan to use microfluidic technology to synthesis controllable hydrogel beads, and add the barcoding sequences on them. Because hydrogel beads have good elasticity, they can deform in microfluidic chip channels smaller than their size and form an orderly single row, which significantly improves the Poisson distribution, thereby improving single cells usage efficiency. The throughput of sequencing provides a new technology for the development of single-cell sequencing.

随着测序技术的飞速发展，基于单细胞的测序已成为该领域发展的主要方向之一。虽然研究者们已经开发出多种基于单个细胞测序的方法，然而这些方法的通量的和成本仍是限制单细胞测序技术发展的关键问题。微流控技术为高通量单细胞测序技术提供了一种极具发展潜力的新型平台，该技术可以产生数以万计的微液滴作为微反应器进行单细胞的包被，并通过在液滴中加入一个负载有捕获以及条码序列的微珠，以实现捕获单细胞核酸的目的。然而，在液滴包被细胞和微珠时所产生的泊松分布问题，是制约该技术实现高通量单细胞测序的关键瓶颈。本项目针对泊松分布这一瓶颈问题，拟利用微流控技术制备可控的水凝胶微球，并利用该微球作为核酸捕获和条码序列的载体。由于水凝胶微球具有良好的弹性，因此他们可以在小于其尺寸的微流控芯片通道内形变，并形成有序的单排通过，从而显著的改善泊松分布的问题，进而提高单细胞测序的通量，为单细胞测序领域的发展提供一种新型技术。

本项目针对现有基于液滴微流控单细胞测序方法中捕获核酸微珠与单细胞悬液在液滴包被过程中因泊松分布导致通量较低的瓶颈问题，拟通过制备具有弹性的水凝胶微珠，使其只能单排通道尺寸略小于其直径的通道，改善捕获核酸微珠的泊松分布，从而提高液滴单细胞与捕获核酸微珠的配对效率，提高单细胞测序通量。首先，经过对水凝胶微珠的配方、尺寸、核酸连接方式、液滴芯片流速比等参数，制备了两种水凝胶微珠。其次，利用水凝胶微珠，我们将液滴中仅含有一个微珠的数量提升到了50%以上。然后，我们也测试了水凝胶微珠的在液滴中的溶解以及在液滴内完成反转录的过程。此外，我们也尝试了水凝胶微珠的保存方式、工业化放大制备流程等工艺，然而，部分结果未能达到预期效果。.除了合成水凝胶微珠外，我们也探索了基于液滴单细胞测序平台的产品及功能研发。首先，采用了负压的方式，简化了液滴单细胞测序平台对于高精度注射泵的依赖。其次，利用精密注塑的方法开展了微流控芯片的大规模量产，以及芯片封接、表面修饰等工作。目前液滴芯片已经完成中试，并达到万片的生产工艺。本项目所构建的基于液滴微流控单细胞测序平台，以转化为单细胞测序产品（DNBeLab C4）的核心部分之一，开始为我国生物医学领域提供产品和技术服务。.项目实施以来，认真按照研究计划开展各项任务，取得了一系列有显示度的研究成果，整个项目组完成3篇SCI研究论文，申请发明专利2项，获得实用新型专利授权2项，完成了任务书中所述的研究目标。