供肝TCF7L2基因rs290487位点突变参与肝移植术后新发糖尿病发生的分子机制研究

Under the support of National Natural Science Foundation of China (81100321), we found a close association between donor graft TCF7L2 gene polymorphisms and the risk of new-onset diabetes after transplantation (NODAT) and performed a primary exploration of the underline mechanism. The important findings were that T to C mutation at rs290487 locus could lead to a down-regulation of exon 14 expression, and a reduction of glucose uptake and insulin sensitivity in liver cells. We also found that high dose tacrolimus contributed to a decrease of glucose uptake of liver cells and reduce the expression of TCF7L2 protein. Based on the previous findings, we will use TALEN knock-in technique, RQ-PCR array, CHIP-seq, liver specific gene knock-out mice, and in silico analysis to perform the following study: ① the effect of TCF7L2 gene s290487 locus mutation on mRNA splicing, protein encoding, transcript factors binding and liver cell glucose uptake；② the role of exon 14 encoding in TCF7L2 protein function, including DNA binding and activation of Wnt and PI3K pathway, and hepatic glucose metabolism；③ the impact of immunosuppressant agent on TCF7L2 function and hepatic glucose metabolism. We aim to clarify the role of TCF7L2 gene rs290487 locus mutation in hepatic glucose metabolism, and the molecular mechanism of NODAT in liver transplantation.

在青年基金支持下，申请者发现了供肝TCF7L2基因多态性与肝移植术后糖尿病（NODAT）之间的密切关联性并进行了分子机制的初探。围绕前期"rs290487位点T→C突变引起14号外显子表达下降，肝细胞胰岛素敏感性和糖代谢能力减弱；免疫抑制剂引起TCF7L2表达下降"这一重大发现，申请者拟通过TALEN技术、RQ-PCR array、ChIP-seq、小鼠条件性基因敲除和in silico分析等方法，开展以下研究：①TCF7L2基因rs290487位点突变对基因剪切调控、蛋白编码、转录因子绑定的影响研究；②第14号外显子在发挥TCF7L2蛋白功能中的作用（包括DNA结合、Wnt和PI3K等重要通路的激活等）及对肝糖代谢的影响研究；③免疫抑制状态对TCF7L2功能及肝糖代谢的作用研究。旨在阐明TCF7L2基因rs290487位点突变对肝糖代谢的调控作用及移植状态下引起NODAT的可能机制。

我们针对既往TCF7L2基因rs290487位点T→C突变导致肝移植术后新发糖尿病（NODAT）风险增加这一重要发现进行分子机制的探索，围绕前期“rs290487位点T→C突变可能通过改变基因剪切和蛋白结构，从而减弱肝细胞胰岛素敏感性和糖代谢能力；免疫抑制剂Tacolimus引起TCF7L2表达改变”这一工作基础和科学假设，我们通过临床队列研究、组织样本检测、CRIPR/Cas9基因编辑、多维多组学分析等技术，开展了以下研究：1.揭示了中国人群肝移植术后新发糖尿病（NODAT）的重要特征，评估及建立了预后预警模型，临床研究部分提示了NODAT的病生表现为胰岛素抵抗型为主，肝脏TCF7L2基因突变介导的肝脏糖脂代谢稳态失衡可能在NODAT中发挥重要作用；2.利用CRIPR/Cas9技术构建PLC/PRF/5突变株T/T型（vs.野生型C/C），细胞糖代谢模式分析发现C/C型糖酵解加强，乳酸增多为肝糖异生提供更多底物最终增加糖生成；而进食后胰岛素信号通路可能受损使得糖摄取下降，表现为胰岛素抵抗，进行Chromatin-RNA- metabolomics多组学分析从多维度证实糖代谢表型差异。研究为东亚特别是中国人群特有的高危位点rs290487突变如何导致糖尿病（肝源性）提供了有力依据；3.针对移植受者免疫抑制这一特殊环境，我们研究发现了免疫抑制剂tacrolimus相关的MicroRNA特征谱，从MicroRNA-mRNA-蛋白水平揭示了tacrolimus调控的移植肝糖脂代谢稳态失衡机制，并为分子治疗提供新靶点，有望减少免疫抑制剂毒副作用降低NODAT发生率。本项目共发表SCI论文8篇，会议论文6篇，培养研究生3名，国际大会报告4人次，获得国际肝移植协会2项奖励。