泛素连接酶Rad18在肝细胞对氢醌所致DNA损伤反应中的作用机制研究

Lesions in DNA are frequently caused by environmental and genotoxic agents. To maintain the integrity of genome, Cells have evolved mechanisms termed the "DNA damage response " to deal with DNA lesions. Recent studies suggest that ubiquitin ligase Rad18 plays an important role in DNA damage response. However, the molecular mechanism of DNA damage response mediated by Rad18 has not been fully elucidated. In this study, Rad18-deficient cell line for L-02 cell will be established through RNA interference and the mechanism of action of Rad18 will be investigated. By comparing the differences between normal L-02 cells and Rad18-deficient L-02 cells treated with hydroquinone in expression levels and Sub-cellular localization characteristics of DNA repair enzymes, translesion synthesis polymerases, cell cycle checkpoint proteins and other related factiors, in ubiquitination status of PCNA, FANCD2, H2A and H2B, and in characteristics of cell biology and genetics, and combined with the screening and identification of the substrates of Rad18, the reaction rules of L-02 cells to DNA damage caused by low dose hydroquinone under the conditions of different Rad18 expression levels will be explored at the cellular and molecular levels and the mechanism of Rad18 in DNA damage response induced by hydroquinone in L-02 cells will be clarified, which will provide scientific theoretical basis to establish the body defense system to the damage caused by hydrquinone.

环境中的遗传毒性因素常常会引起DNA损伤。为了维持基因组的完整性，细胞通过进化形成了一套称为DNA损伤反应的机制来处理DNA损伤。近年来的研究发现，泛素连接酶Rad18在DNA损伤反应中起着重要的作用，但Rad18介导DNA损伤反应的分子机制尚未完全阐明。本研究拟应用RNA干扰技术建立L-02细胞的Rad18基因缺陷细胞株，通过比较氢醌处理后正常肝细胞与Rad18基因缺陷肝细胞之间DNA修复酶、跨损伤合成聚合酶、细胞周期检查点蛋白及其它相关因子的表达和亚细胞定位特征，PCNA、FANCD2、H2A和H2B泛素化状况，以及细胞生物学和遗传学特征，并结合Rad18作用底物的筛选和验证，在细胞和分子水平上探讨Rad18的不同表达水平条件下细胞对氢醌所致DNA损伤的反应规律，阐明Rad18在氢醌诱导肝细胞DNA损伤反应过程中的作用机制，从而为建立机体对氢醌所致损伤的防御体系提供科学的理论依据。

Rad18是一种泛素连接酶，它在各种遗传毒性因子所诱发的DNA损伤旁路和复制后修复中起着重要作用。研究表明，Rad18与机体对氢醌（HQ）所致毒性之间存在联系。为了进一步认识Rad18在HQ所致DNA损伤反应中的作用机制，我们采用RNA干扰技术来选择性敲低Rad18在L-02细胞内的表达水平，并通过测定其对细胞生物学特性、基因组稳定性、DNA损伤反应相关蛋白的表达水平、泛素化程度及其亚细胞定位特征，以确定Rad18的缺失是如何影响肝细胞对HQ所致DNA损伤的反应。此外，我们还采用免疫共沉淀、免疫荧光和泛素化实验筛选和鉴定了Rad18的作用底物。结果发现，Rad18表达的抑制导致了HQ作用下肝细胞增生的减少，并使肝细胞对HQ所致细胞毒性的敏感性增强；Rad18的缺陷明显增加了HQ所引起的肝细胞基因组不稳定性；Rad18表达的抑制在肝细胞内增强了HQ所诱发的细胞凋亡效应和细胞周期的S期阻滞。本研究也发现，HQ作用条件下，Rad18的缺陷明显增加了ATM、chk1、p53、53BP1、PARP-1和Ku70在肝细胞内的表达水平，也明显降低了Ubi-FANCD2、Ubi-PCNA、Ubi-H2B、Polη、REV1和WRN的表达水平，并可导致chk1和p53由胞浆移位至胞核；HQ可在肝细胞内引起ATM、Chk2、p53和H2AX的强烈磷酸化，并且其磷酸化效应在Rad18缺陷的肝细胞内得到了明显增强。此外，本研究还发现，Rad18与53BP1在肝细胞内共定位并相互作用，而该种作用在HQ处理下能够以剂量依赖性方式得到加强，并且Rad18在体内及体外均能使53BP1发生泛素化。总之，Rad18可能通过调节细胞增生、凋亡、细胞周期、DNA修复、跨损伤合成、DNA损伤关卡和泛素化而在肝细胞对HQ所引起的DNA损伤反应中发挥着重要的作用。本研究可为建立机体对HQ所致DNA损伤的防御体系提供科学的理论依据。