甘蔗黑穗病菌致病机理研究

甘蔗黑穗病是世界各蔗区的主要病害，在我国也广泛发生。病株蔗茎细小，产量减少，糖分降低，没有商品价值。甘蔗黑穗病菌具有不同配合型的担孢子，两个亲合的担孢子萌发后经过质配形成双核菌丝，才能在甘蔗体内生长蔓延。因此，研究担孢子及双核菌丝的表达差异将有助于了解该菌的致病机理。本项目拟采用Solexa测序技术，开展甘蔗体外、体内黑穗病菌转录组测序，获得这两种重要生长态下的基因表达信息,预测候选致病相关基因。同时，运用基因敲除, RNA干扰技术和基因敲入方法，验证候选致病相关基因的功能，从而发现重要致病基因,并初步阐明该病原菌的致病机理，为今后培育甘蔗抗病品种和开发新的甘蔗黑穗病防治技术和方法提供理论依据。

甘蔗黑穗病菌具有不同配合型的担孢子，两个亲合的担孢子萌发后经过质配形成双核菌丝，才能在甘蔗体内生长蔓延。因此，研究担孢子及双核菌丝的表达差异将有助于了解该菌的致病机理。.测定了人工培养条件下JG35和JG36单倍体担孢子的转录谱，获得JG36菌株转录组原始数据1.12Gb，JG35转录组数据1.24Gb；测定甘蔗体内的二倍体菌丝体的转录谱，在侵染早期的甘蔗生长锥中获得原始数据3.86Gb，在侵染中期获得原始数据2.96Gb。分析发现JG35有6,274个基因表达，JG36有6,269个基因表达，在二倍体中有6,492个基因表达。参考玉米瘤黑粉菌和玉米丝黑穗菌的致病基因簇信息，识别到47个致病小分泌蛋白基因，分布在5个基因簇上。比较预测到PEP1，Tin2，Srt1，O-mannosylated Pmt4，Pmt1，Tea4，Hum3，Rsp1，Cwh41和Sho1共10个重要的致病因子。.通过根癌农杆菌介导的转化方法（ATMT），获得JG35 和 JG36菌株的25056个转化子，筛选到了1株来自JG36菌株、不能进行有性配合的突变体，编号为248E3。.采用hiTAIL-PCR、RT-PCR、3’RACE方法及筛选基因组数据库，获得突变体T-DNA插入位点基因的全长序列，经Blastx比较，发现该基因与玉米丝轴黑粉菌可能的信息素响应因子prf1（probable pheromone response factor Prf1）、玉米黑粉菌的prf1基因、大麦坚黑粉菌的prf1相关基因同源性分别为78%、57%和56%，将248E3破坏的基因定名为甘蔗黑穗病菌信息素响应因子SsPrf1。经分析比较发现它属于高迁移率组（The high-mobility-group）盒子超级家族，具有真菌的交配型基因产物MC、MATA1和Ste11。.构建SsPrf1基因互补转化子，获得的2个互补株C248E3-2和C248E3-34能很好地恢复有性配合能力，将SsPrf1互补株C248E3-34扩大繁殖后，与等量的JG35混合接种甘蔗，接种后90天，与野生型组合JG35/JG36一样，C248E3-34与JG35组合接种的甘蔗出现症状，接种后120天，抽出了黑穗，说明互补株C248E3-34恢复了致病力。