选择性抑制TLR7/9活化的脱氧寡核苷酸的结构特征及可能靶点

TLR7和TLR9除了感受病原体核酸外，也感受宿主RNA或DNA并启动自身免疫应答，虽然关于TLR7/9是如何识别自己和非己核酸的还不清楚，但抑制TLR7/9介导的免疫应答已经成为防治自身免疫病发生发展的一个战略。近几年有研究发现DNA分子能抑制TLR7/9的活化，尤其富含鸟嘌呤的单链脱氧寡核苷酸（G-ODN）对核酸的免疫刺激有抑制作用，我们在前期工作中发现不含鸟嘌呤的ODN（noG-ODN）也能选择性地抑制TLR7/9活性。研究发现，TLR7/9与配体结合之前存在于内质网中，内质网膜蛋白Unc93B1负责运输TLR7/9。推测noG-ODN可能靶向内质网抑制TLR7/9活性。本课题拟研究noG-ODN与内质网的相关性，同时观察其与TLR7/9适配体MyD88的相关性，揭示其可能作用靶点，并以CCT为基本基序确定其结构特征，为研制防治TLR7/9活化相关性自身免疫性疾病的药物奠定实验基础。

本课题主要围绕选择性抑制TLR7/9活化的NoG-ODN（SAT05f）的作用靶点及其结构特征，利用人pDC样细胞系CAL-1细胞及小鼠脾细胞展开体外研究，并尝试在小鼠体内研究SAT05f及其变构体的免疫抑制活性。关于SAT05f的可能作用靶点，以CAL-1细胞作为效应细胞，研究SAT05f与内质网关系，TLR7/9及Unc93B1（TLR7/9运输蛋白）mRNA表达水平及其下游NF-kB、IRF7和IL-10、TNF-a、IFN-a表达水平的关系；关于NoG-ODN的结构特征是围绕SAT05f变构展开的。实验中始终以MS19（一种由AAAG重复序列组成的ODN）为对照ODN。.研究发现：.（1）SAT05f能抑制CpG ODN诱导TLR9从内质网向外移行，也能抑制自身基因组DNA、病毒DNA及外源DNA诱导TLR9从内质网向外移行；能抑制咪喹莫特（IMQ）和流感病毒诱导TLR7从内质网向外移行；能抑制负责TLR7/9从内质网向外移行的内质网跨膜蛋白Unc93B1的移行，但并不与Unc93B1直接结合。 .（2）SAT05f与IMQ联合应用2h能明显上调Unc93B1 mRNA水平；单独作用2h和24h明显上调TLR9 mRNA水平，且24h更明显；单独或与IMQ联合作用2h能上调TLR7 mRNA水平；能在一定程度上调节TLR7/9下游转录因子及细胞因子的mRNA表达。.（3）SAT05f及其变构体对CpG ODN诱导小鼠脾细胞增生的抑制活性有差异，CCT基序重复8次以上的NoG-ODN有抑制活性，且呈长度依赖性；3'-端和中间的CCT基序对维持其抑制活性更重要，且3'-端充分暴露对其抑制活性的发挥是必须的。.（4）SAT05f及其变构体也能抑制CAL-1细胞结合和摄取CpG ODN，并且在D-GalN和CpG ODN诱导的致死性休克模型小鼠体内也能发挥免疫抑制活性。.（5）研究中意外发现由AAAG重复序列组成的MS19能减轻流感病毒感染所致的小鼠肺损伤，其机制可能与其抑制肺组织中性细胞浸润及TNF-a活性有关。