STAT家族蛋白对谷氨酰胺酶（GLS1）转录调控的机制研究

Glutaminase is vital in HIV-associated neurocognitive disorders (HAND), however, the transcriptional regulation is still unclear. In our previous studies, we found that: 1. Interferon (IFN-a) activates glutaminase promoter and its transcription. 2. IFN-a?stimulation and HIV infection activate STAT1, increase its binding with STAT binding site in glutaminase promoter. 3. Both IFN-a?stimulation and HIV infection increase glutaminase protein levels and its product, glutamate, which is vital in HAND. Interestingly, we found that there are 8 putative STAT binding sites in glutaminase promoter, in which 2 sites when mutated loose the promoter activity. In this grant application, we will further study the molecular mechanisms of how STAT family proteins regulate the glutaminase transcription. 1. Construct and detect the promoter activity after the promoter is mutated with single or double STAT binding sites or the truncation construct deleing some STAT binding sites using dual-luciferase assay. 2. Detect the binding of STAT1, STAT2, STAT3 with glutaminase promoter with IFN-a stimulation or HIV infection by EMSA and ChIP assays. 3. Using STAT1-deficient cell line (U3A) and STAT1 overexpression, STAT2, STAT3 knocking down or overexpression to study their function. In summary, we will the function of STAT family protein and the related family protein, such as its inhibitors (SOCS and PIAS) in regulating glutaminase transcription, and the different function of the 8 STAT putative binding sites in HIV infection. These studies will provide more understanding for the therapy of HAND.

谷胺酰胺酶在人类免疫缺陷病毒（HIV）相关的神经认知障碍中起重要作用，但是其转录调控机制并不清楚。我们前期的工作发现干扰素刺激和HIV感染都能提高谷胺酰胺酶的表达，影响其在HIV相关的神经认知障碍中起重要作用。我们发现谷胺酰胺酶启动子区域上有8个潜在的STAT结合位点，其中两个位点分别被突变后启动子的活性完全消失。本课题进一步研究STAT家族蛋白对谷胺酰胺酶的转录调控作用。1.通过构建谷胺酰胺酶启动子STAT潜在结合位点的单突变体，双突变体以及去掉部分STAT潜在结合位点的系列剪切的质粒，用双荧光素酶法测启动子活性来研究各位点的功能。2. EMSA和染色体免疫共沉淀（ChIP）法检测STAT家族蛋白在干扰素刺激和在HIV感染过的情况下与谷胺酰胺酶启动子区域的结合。 3.在STAT缺失和高表达细胞中检测谷胺酰胺酶启动子的活性。最终为HIV感染相关认知障碍疾病的生物预防及靶向治疗提供依据。

单核吞噬细胞，是HIV感染的主要靶点，可以产生并且释放神经毒性因子包括谷氨酰胺，进而在人类免疫缺陷病毒（HIV）相关的神经认知障碍疾病中起重要作用，谷胺酰胺酶(glutaminase)是产生谷胺酰胺的酶，因而在上述疾病中起关键作用，但是其转录调控机制并不清楚。我们已经报道在HIV-1感染的单核吞噬细胞和人脑组织中，谷胺酰胺酶表达增高，而且发现干扰素刺激和HIV感染都能提高谷胺酰胺酶的表达，其中都是通过调控因子STAT1调节谷胺酰胺酶启动子的活性而完成。通过基因组DNA序列比对，我们发现谷胺酰胺酶启动子区域上有8个潜在的STAT结合位点。为了进一步研究各位点的功能，我们把每个STAT结合位点都突变成序列ACTAGTCTC，发现有六个突变（mut 1,3,4,5,7,8）显著提高启动子的活性，而另外两个突变使得启动子的活性完全消失。为了进一步确定位点2和位点6能否影响旁边具有抑制性位点的功能，尤其是临近的位点3和位点5，我们构建了同时具有位点2和位点3，或者位点6和位点5双突变的质粒。结果显示，与野生型启动子比较，有双突变的启动子的活性显著提高，这一结果也表明了位点2和位点6这两个位点具有激活性，其余6个位点具有抑制性。为进一步确定各位点的活性，我们还构建了去掉部分STAT潜在结合位点的剪切质粒，进一步证实了各个位点的功能。通过ChIP实验，我们验证STAT1和STAT3转录调控因子在干扰素刺激和HIV-1感染的单核细胞来源的巨噬细胞中能直接和谷胺酰胺酶基因启动子结合，其中各个不同的结合位点的结合还有不同。有趣的是，我们还发现大鼠谷胺酰胺酶启动子调节和人类谷胺酰胺酶启动子调节有类似情况。这些结果确定了谷胺酰胺酶启动子调节的关键元素，最终为HIV感染相关认知障碍疾病的生物预防及靶向治疗提供依据。