利用顺磁核磁共振研究固有无规结构蛋白质构象的探索：alpha突触核蛋白的构象分析

More than 30% of eukaryotic proteins contain intrinsically disordered proteins (IDPs)(> 30 amino acids), and most of the IDPs play important roles in cellular processes. However, how the IDPs accomplishing their unique functions remains unclear and how to characterize the conformation exchange of the natively unstructured polypeptide at atomic resolution is still a challenge. This project relies on the applicant's expertise on site-specific labeling of proteins with paramagnetic lanthanide ions, which has been a powerful technique in achieving valuable long-range structural restraints of polypeptides. In this project, we focus on alpha-synuclein as the target protein and extensively study the conformation exchange of alpha-synuclein in solution and its oligomeric states by means of paramagnetic NMR spectroscopy. Fusion a well-structured model protein into alpha-synuclein will be made first and paramagnetic tagging the model protein will be applied subsequently. The determined paramagnetic center in the model protein permits the localization of unstructured polypeptide with respect to the well-structured fold. These new tools will become mainstream in characterizing the conformation exchange of IDPs in structural biology, which fulfills the physiological functions.

固有无规结构蛋白片段占细胞总蛋白量的30%，许多重要无规结构蛋白在生物体内发挥着重要作用。但是无规结构蛋白的功能通过什么方式行使至今是个难题，而固有无规结构的构象分析是当今生物物理研究的挑战。本课题基于申请人多年顺磁核磁共振的研究基础，特别是顺磁标记策略的建立和发展，提出解析固有无规结构蛋白构象的新思路。首先在固有无规结构上融合一个具有规则结构的小蛋白，而在小蛋白上引入顺磁探针，然后根据小蛋白的空间取向定出无规多肽链的构象。本课题主要以具有重要生理功能的alpha突触核蛋白为目标分子，在其上融合一个稳定结构的小模式蛋白，利用顺磁标记方式阐述突触核蛋白的构象。通过优化小分子模式蛋白与目标分子的融合体，在模式蛋白上引入顺磁探针、优化探针，根据所测量的顺磁信息分析突触核蛋白在溶液、拥挤环境和寡聚态下的构象变化，以对其功能有更深刻的了解。通过此课题的开展，建立一套分析固有无规结构蛋白的新方法。

固有无规蛋白质在生物体内发挥着重要作用，但是其内氨基酸残基所处的化学环境类似，三维构象分析是生物物理方法的挑战，目前大多数蛋白结构研究的技术和方法都是以有结构蛋白为基础发展起来的，并不能满足固有无规蛋白结构的研究需要。生物核磁虽然能从近生理条件下获得蛋白质原子分辨率的结构信息，但是固有无规结构蛋白质的核磁谱图中谱峰往往重叠严重，对核磁共振的实验技术与方法提出了新的挑战。本项目中主要发展通过顺磁标记方法，利用有序结构的参照系和长程的顺磁信息定位无规蛋白质的核磁信号，从而获得顺磁信息，通过有序结构参照系和计算得到的磁感应张量研究固有无规结构的溶液构象。本项目以ubiquitin和GB1为有序结构蛋白，并分别融合到-synuclein上，通过顺磁标记ubiquitin或GB1，以此获得磁感应张量，进而分析-synuclein核磁信号与相应的顺磁信息，从而分析-synuclein的溶液构象。融合蛋白并不改变-synuclein的结构，该顺磁方法为研究无规蛋白溶液构象提供了重要研究工具。另外本项目还发现顺铂能抑制-synuclein的成纤维并阐述了抑制成纤维的机制。